人脐带间充质干细胞源外泌体对缺氧条件下RPE细胞生物学特性的影响

为了探讨人脐带间充质（HUMSC）外泌体对缺氧条件下人视网膜色素上皮（RPE）细胞的增殖、凋亡及迁移生物学特性的影响，北京大学人民医院徐宁达， 黄旅珍等人采用组织块贴壁培养法原代培养HUMSC，扩增传代至第4代，流式细胞仪鉴定其细胞表面标志物；收集培养第4代HUMSC无血清培养基，分离提取外泌体，在电镜下观察其超微结构并用免疫印迹法鉴定其CD63、CD9蛋白表达；体外培养RPE细胞用噻唑蓝（MTT）法检测缺氧0、1、2、3、4、5 d的细胞增殖情况；用细胞划痕实验检测缺氧0、24、48、72 h的细胞迁移情况，并结合实验确定缺氧时间。处于生长旺盛期的RPE细胞分为5个组，分别为对照组、缺氧组及不同剂量外泌体预处理组（100、200、300 μg/ml），培育48 h后采用MTT法观察各组细胞的增殖能力，Annexin V/碘化丙啶（PI）双染流式细胞术观察细胞凋亡，细胞划痕实验中观察各组细胞的迁移功能。

结果发现，流式细胞仪检测第4代HUMSC的表面标志CD105、CD73、CD90呈强阳性表达，体外诱导成脂和成骨细胞，提示分离培养的HUMSC具有MSC特异性表型。分离的外泌体经扫描电镜观察可见大小不一的球状膜性结构，且免疫印迹法结果提示CD63、CD9呈阳性表达。体外培养RPE在缺氧0、1、2、3、4、5 d用MTT法检测细胞增殖结果：与对照组比较，吸光度（A）值差异均有统计学意义，前2 d随缺氧时间延长，RPE细胞的增殖能力逐渐增强（A值为1.862±0.135和2.278±0.244）；3 d后RPE细胞的增殖能力逐渐减弱（A值为1.419±0.124和1.599±0.156）。细胞划痕实验结果：随着缺氧时间的延长，RPE细胞迁移距离逐渐增加，至72 h全部长满且无缝隙。RPE细胞凋亡实验检测结果：缺氧前2 d，随缺氧时间延长细胞凋亡数量有差别[3.628%±1.348%、20.123%±1.183%]，3 d时细胞凋亡数量较多（42.290%±3.217%），与2 d比较差异有统计学意义。缺氧48 h后MTT法检测细胞增殖结果：与对照组（1.870±0.499）比较，缺氧组（2.616±0.307）细胞增殖数显着增加（t=-3.116，P 0.05）；与缺氧组比较，外泌体预处理组细胞增殖数减少（2.041±0.115、1.931±0.205、1.929±0.025）（t=-4.290，-4.547，-5.286；P 0.01），外泌体各剂量组之间差异无统计学意义（F=1.181，P 0.05）。采用Annexin V/PI双染流式细胞仪观察细胞凋亡结果：与对照组（1.180%±0.689%）比较，缺氧组细胞凋亡数（19.273%±1.194%）显着增加（t=-32.141，P 0.01）；与缺氧组比较，外泌体预处理组的细胞凋亡数显着减少（12.318%±1.087%、11.878%±1.348%、11.090%±1.716%；t=-10.547，-10.057，-9.589；P 0.01），外泌体各剂量组之间差异无统计学意义（F=1.173，P 0.05）。细胞划痕实验结果：与对照组比较，缺氧组细胞迁移距离显着增加；与缺氧组比较，外泌体预处理组细胞迁移距离减小（t=11.766，10.770，11.311；P 0.01]，外泌体各剂量组之间差异无统计学意义（F=1.179，P 0.05）。

本研究发现HUMSC外泌体可有效抑制缺氧状态下人RPE细胞增殖、凋亡及迁移，为寻找缺氧导致RPE相关疾病的研究和治疗提供理论依据。(100yiyao.com）

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