Nature子刊：我国迷信家提醒干细胞衍素性外泌体修复缺血性肌肉毁伤机制

2021年4月9日讯/BIOON/---下肢缺血是一种重大的临床症状，影响着全天下许多患者，今朝尚无无效的医治办法。缺血激活NLRP3炎性体，进而通过开释炎症性细胞因子IL-1β和IL-18触发组织毁伤。然而，NLRP3炎性体激活的分子机制在很年夜水平上仍旧未知。

在一项新的研讨中，来自中国姑苏年夜学、广州医科年夜学、阜外病院、中山年夜学和吉林年夜学第二病院的研讨职员应用RNA测序（RNAseq）比拟了缺血的肌肉和正常肌肉的mRNA表白。RNAseq显示Rb1（retinoblastoma-1）、NLRP3炎性体、IL-1β和IL-18的mRNA程度添加（图1a，b），这一点在qRT-PCR试验中获得证明（图1c）。这些发现也通过Western blot（图1d）和ELISA（图1e）在卵白程度上获得了验证。对这些上调的基因进行基因本体阐发，提醒了缺血肌肉中与炎症反馈路径和NLRP3炎性体相关的生物学进程，从而证明炎症相关旌旗灯号通路参加缺血诱导的肌肉毁伤（图1f）。为了验证RNAseq数据，这些作者还进行了卵白测序。热图（heat map）和Spearman相关阐发显示，缺血肌肉中Rb1、NLRP3、IL-1β和IL-18存在优越的卵白-mRNA相关性。

Rb1卵白是一种已知的克制卵白，Rb1的失活会匆匆进骨骼肌细胞的增殖，然则Rb1在缺血性肌肉毁伤中的作用仍旧未知。为相识决这个成绩，这些作者构建出肌肉特同性Rb1基因敲除（Rb1-mKO）小鼠。在缺血性后肢毁伤后，Rb1-mKO小鼠的血流复原比对照组小鼠快。在毁伤后28地利，Rb1-mKO小鼠的后肢握力、耐力以及骨骼肌与体重的比值也较高。这些成果标明，Rb1基因的丧失可以匆匆进毁伤后的骨骼肌修复。此外，Rb1-mKO小鼠肌肉中NLRP3和Caspase-1的卵白表白以及IL-1β和IL-18的血浆程度均低于对照组小鼠，这标明Rb1基因的缺失招致NLRP3旌旗灯号通路遭到克制。为了证明这些发现，他们通过用脂多糖（LPS）和ATP刺激C2C12成肌细胞（myoblast），树立了炎性体激活的体外模子。敲降Rb1（Rb1-）加强了细胞增殖，下降了NLRP3和Caspase-1的激活，并下降了IL-1β和IL-18的程度。

图1.肿瘤克制卵白Rb1是骨骼肌中的一种NLRP3炎性体诱导剂。图片来自Signal Transduction and Targeted Therapy, 2021, doi:10.1038/s41392-021-00520-8。

这些作者应用STRING数据库鉴定出调控Rb1的下游旌旗灯号分子，发现它与CDK6和转录因子E2F互相作用。曩昔的研讨已标明miR-29b靶向CDK6，是以他们研讨了miR-29b是否调理CDK6/Rb1。正如Targetscan所示，CDK6 mRNA的3’UTR有miR-29b的多个联合位点，并且双荧光素酶试验证明CDK6是-29b的靶点。此外，miR-29b模拟物克制了C2C12细胞中CDK6卵白的表白和Rb1卵白的磷酸化。

为了确定miR-29b是若何被调控的，这些作者使用环状RNA （circRNA）测序来比拟缺血肌肉和正常肌肉中circRNA的表白。在缺血肌肉中检测到几种匆匆进细胞增殖的circRNA（cPWWP2A、circ_CCDC66和circ_HECTD1）。在这些circRNA中，cPWWP2A的表白最强，但在缺血前提下，它的表白量急剧降低。这些发当初qRT-PCR试验中获得证明。

因为衍生的外泌体可以匆匆进组织修复，这些作者将对照外泌体(NC-Exos)或缄默cPWWP2A表白的外泌体（si-Exos）注入缺血肌肉，以确定cPWWP2A是否参加介导源自人脐带衍生间充质（UMSC）的外泌体（UMSC-Exos）在肌肉中的无益作用。NC-Exos处置招致肌肉中cPWWP2A的表白添加，而si-Exos削弱了这种表白。与打针NC-Exos的小鼠相比，si-Exos处置招致血流复原较慢 (图1g、h)，活动功效较差，肌肉力气和跑步间隔削减，肌肉与体重比下降，NLRP3、Caspase-1表白较高(图1i)，血浆中IL-1β和IL-18程度添加(图1j)。这些打针到小鼠体内的外泌体直径为30～100nm，仅在肌肉中检测到。与转染NC-Exos的细胞相比，转染si-Exos的C2C12细胞中NLRP3和Caspase-1的表白量显明更高。是以，在si-Exos处置后，IL-1β和IL-18的程度添加了，而且细胞增殖遭到克制。

这些作者基于CircBank阐发确定了miR-29b和cPWWP2A之间的互相作用（图1k）。cPWWP2A和miR-29b之间的分割在双荧光素酶试验中获得证明，该试验显示miR-29b与cPWWP2A存在较强的联合(图1l)。miR-29b在缺血肌肉中的表白添加了，这与cPWWP2A的表白相反。这些成果标明，cPWWP2A是miR-29b的分子海绵（molecular sponge）。为了验证cPWWP2A/miR-29b调控NLRP3旌旗灯号通路，用miR-29b克制剂处置C2C12细胞，这下降了NLRP3和Caspase-1的表白以及IL-1β和IL-18的开释，但加强了C2C12细胞增殖，不外这些效应可被si-Exos逆转（图1m）。响应地，敲降C2C12细胞中的cPWWP2A招致CDK6 mRNA和卵白的表白削减。此外，C2C12细胞的分解被cPWWP2A siRNA克制，但被miR-29b克制剂激活。这些数据标明，cPWWP2A通过miR-29b/CDK6路径调理Rb1。