自然子课题:合成能源系统双引擎辅助细胞工厂的合理设计与建造 |
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重复脱羧是细胞还原代谢的基础,所以构建新的能量系统首先要构建重复脱羧循环。在戊糖磷酸途径中,葡萄糖6-磷酸(G6P)催化成核糖5-磷酸(R5P)时,损失一分子CO2,生成两分子NADPH,这就是氧化阶段。之后C5分子发生可逆重排,最终重构为果糖-6-磷酸(F6P)和甘油醛-3-磷酸(G3P),这是一个非氧化阶段。G3P可以通过一些糖异生途径回到G6P,再次进入氧化阶段,从而形成PP循环。在这个循环中,一个葡萄糖分子被完全氧化生成12个NADPH分子。NADPH是细胞内还原力的通量,NADH可以通过氧化呼吸链产生ATP。研究人员在酵母中过量表达内源性谷氨酸转氢酶GDH1和GDH2,实现了细胞质中一分子NADPH向一分子NADH的不可逆转化。
研究人员选择了一种消除了葡萄糖效应的丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株E1B[1](更名为SynENG001)来测试PP循环和氢转移循环的碳通量。该菌株以氧化磷酸化为主要供能过程,能在单一葡萄糖碳源上生长,具有良好的胞质NADH平衡能力。研究人员敲除了磷酸果糖异构酶基因pgi1,中断了糖酵解途径,增加了PP的循环碳通量,获得的菌株SynENG064不能以糖为单一碳源生长。然而,在添加氢转移循环后,获得的菌株SynENG065可以在5天内生长至OD600 nm=10(图2b)。因此可以推断,pgi敲除后,细胞内NADPH过量,抑制细胞生长。在野生酵母中敲除pgi和过量表达GDH2只能部分恢复细胞生长。研究人员推测,这是因为氢转移循环产生的过量NADH抑制了细胞生长,因此细胞需要一个有效的呼吸链来清除细胞质中过量的NADH。以上结果证实PP循环和氢转移循环运行良好,两个模块均具有较高的碳通量。
琥珀酸是一种四碳二羧酸。从丙酮酸合成琥珀酸需要细胞提供额外的还原能力NADH。研究人员在SynENG001菌株中过量表达琥珀酸合成所需的基因,并下调磷酸果糖激酶(PFK)的表达水平,以促进更多的碳流向PP循环,使琥珀酸产量增加到约3.3 g/L。在这个过程中,研究人员还发现了甘油的积累,这表明PP循环和氢转移循环导致细胞中过量的NADH。
研究人员模拟线粒体中的氧化呼吸链,表达两种外源NADH脱氢酶NDE1和NDE2,将细胞质NADH与线粒体电子传递链相连,从而获得菌株SynENG012。当TCA循环的关键基因异柠檬酸脱氢酶IDH2的表达水平下调时,细胞生长逐渐受损甚至死亡。放入合成能量系统(氢转移循环和外呼吸链)后,细胞生长不受影响。这些结果表明,合成能量系统可以代替细胞中原有的能量系统发挥作用,支持细胞生长。
在天然产油真菌中,线粒体中异柠檬酸脱氢酶的损伤会导致产油过量。因此,在前期的研究中,研究人员对优化的游离脂肪酸(FFAs)生产菌株中IDH2的表达进行了动态调控,获得了菌株Y Z032[2]。然而,摇瓶发酵后,细胞生长和游离脂肪酸产量下降。研究人员推测,这是由于细胞内能量供应不足,因此放入了氢转移循环和外部呼吸链,获得的菌株SynENG024生物量增加了100%,FFA产量增加了200%。这进一步证明了合成能量系统可以支持细胞生长和高还原性化合物的产生。
此外,研究人员还表达了不同来源的果糖-1,6-二磷酸酶FBP1,以改善NADPH的供应。使用不同的启动子来微调NADPH与ATP的比例,但是没有观察到FFAs产量的显著增加。因此,非氧化糖酵解(NOG)途径在细胞中表达,PP途径部分转向乙酰辅酶a的合成。正如预期的那样,FFAs产量增加了30%。
在补料分批发酵实验中,研究人员在FFAs产生的最佳菌株SynENG050中恢复了完整的TCA循环,以避免高浓度乙醇的积累,并表达了一种FFAs合成途径来竞争碳源和消耗过多的NADH,从而获得菌株SynENG058。发酵后用十二烷萃取,得到20 g/L的FFAs,产量为0.134 g FFAs/g葡萄糖,为最高理论产量。
生物技术的挑战之一是如何在刚性代谢网络的基础上改变细胞内能量(ATP)和还原力(NADH/NADPH)的相对化学计量比,以积累多余的能量/还原力用于产物合成。在这项研究中,构建了一个合成能量系统,为细胞提供额外的能量和减少能量。经过实验验证,该系统可以替代原有的TCA循环,支持高还原度化学品的生产,并配合其他方式高效生产以乙酰辅酶a为前体的化学品。这是第一个由理性设计构建的合成能量系统。这项研究揭示了细胞能量代谢网络的可塑性:尽管经历了数百万年的进化,细胞能量代谢网络仍然可以重建。
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