自然子课题:细菌新型CRISPR抗病毒系统工作机制分析

来源：中国生物技术网2022-11-09 18336019

III-E型CRISPR-Cas系统使用一种称为Cas7-11(也称为gRAMP)的单一多结构域效应子切割RNA，并与半胱天冬酶样蛋白酶Csx29结合，显示了RNA靶向应用的良好潜力。

III-E型CRISPR-Cas系统使用一种称为Cas7-11(也称为gRAMP)的单一多结构域效应子切割RNA，并与半胱天冬酶样蛋白酶Csx29结合，显示了RNA靶向应用的良好潜力。III-E CRISPR-Cas系统的结构和分子机制尚不清楚。

2022年10月27日，在《Nature Microbiology》发表的一项新研究中，天津医科大学Rolling团队和中科院中国科学院武汉病毒研究所邓增勤团队分析了Cas7-11复合物在不同状态下的冷冻电镜结构，并利用大量生化实验阐明了Cas7-11加工前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，识别和切割靶RNA的机制。我们还发现，Cas7-11对靶RNA的识别可以引起Csx29的构象变化，并可能激活其蛋白酶活性。

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌对抗可动遗传元件入侵的适应性免疫系统。可以分为两类。第一类：由多种效应蛋白功能组成的蛋白复合物，包括型、型和型；通过单一效应蛋白发挥功能的2类包括II型、V型和VI型。最近，研究人员发现了一种新类型的CRISPR-Cas系统，即III-E亚型.该系统在哺乳动物细胞的RNA靶向中具有高活性和低毒性。

与之前发现的多亚基III型系统不同，它由四个Cas7和一个Cas11结构域融合形成一个大效应蛋白Cas7-11/gRAMP，在crRNA的指导下切割靶RNA。Cas7-11可以与半胱天冬酶样蛋白酶(Csx29/TPR-CHAT)(参考文献3)相互作用，形成由CRISPR指导的半胱天冬酶复合物(Craspase)。因此，该系统可能同时具有核酸酶和蛋白酶活性，提示了一种抗噬菌体感染的新机制。

在这项最新研究中，作者首次分析了中国假丝酵母Cas7-11-crRNA(SbCas7-11-crRNA)的二元复合结构。indua Bro DAE，并发现Cas7-11由四个结构相似的Cas7、一个Cas11和一个IPD结构域组成(图1)。IPD是一个位于Cas7.4中部的插入序列，但对其结构和功能的研究尚不清楚。但IPD的删除并不影响靶RNA的识别和切割，提示删除IPD可以构建小型化的基因编辑工具。

图1 CRISPR-Cas系统iii-e型的基因结构

在传统的III型CRISPR-Cas系统中，Cas6蛋白负责前crRNA的加工和成熟，而Cas7-11蛋白本身具有相应的前crRNA加工能力。Cas7-11 crRNA的结构表明，成熟crRNA的重复序列与Cas7.1结构域结合，因此推测Cas7.1结构域可能具有加工前crRNA的能力。接下来，作者设计了一系列突变实验来寻找Cas7.1的活性位点。由于单体SbCas7-11不稳定，因此选择了来自Desulfonema ishimotonii物种的同源蛋白DiCas7-11进行实验。结果表明，DiCas7-11的4个突变体(W20A、R26A、H43A和Y55A)能明显阻断前crRNA的加工(图2)，证明Cas7.1结构域在切割前crRNA中起重要作用。W20和R26在Cas7-11同源物中严格保守，但在SbCas7-11中H43被苏氨酸残基(T45)取代，Y55被苯丙氨酸残基(F57)取代。

图2体外野生型(WT)和突变型DiCas7-11蛋白的前crRNA切割实验。括号是SbCas7-11的相应残基(绿色)

Cas7-11有两个由6个核苷酸分开的靶RNA切割位点，称为位点1和位点2。cas 7-11-crRNA-靶RNA三元复合物结构发现crRNA序列中的两个核苷酸，4A和10U，分别被Cas7.2和Cas7.3结构域的-指状结构颠倒，表明靶RNA切割可能发生在这两个位点附近。在III-A/B系统中，Csm3/Cmr4亚单位通过催化环中保守的天冬氨酸残基来发挥RNase活性。通过比较SbCas7-11和Csm的结构，作者发现Cas7.3中有一个。

对应的保守的天冬氨酸残基（D698）。与预期的一样，D698A突变几乎消除了2位点的target RNA切割（图3左）。然而，在Cas7.2中的对应位置包含一个非保守的丝氨酸残基（S457），并且S457A突变对1位点的切割影响不大。

有趣的是，在同一催化口袋中的酸性残基D547的突变，几乎消除了SbCas7-11在1位点的切割活性（图3中）。更有趣的是，序列比对显示，在大多数Cas7-11同源物中，这两个相应位置上一般只会出现一个酸性氨基酸。例如，SbCas7-11有S457-D547，而DiCas7-11在对应的位置上是D429-N518。因此，作者提出了在这两个位置上的氨基酸可能存在功能冗余的假设，并做了功能丧失和功能获得突变来验证这一假设。与预期的一样，结果表明Cas7.2催化口袋的这两个活性位点酸性残基可能在功能上是等价的：两个位置的任何一个天冬氨酸残基都可以对target RNA进行切割（图3右）。

图3 左，Cas7.3结构域突变的体外target RNA切割。中， Cas7.2结构域突变的体外target RNA切割。右， Cas7-11同源物的序列比对

为了研究Cas7-11如何调控Csx29的机制，作者解析了Cas7-11-crRNA-Csx29三元复合物和Cas7-11-crRNA-target RNA-Csx29四元复合物的电镜结构。结构揭示Csx29在target RNA的存在下发生了明显的构象变化：TPR区域靠近Cas7-11，而蛋白酶PS结构域远离Cas7-11，使得Csx29的两个催化残基H585和C627在空间上更加靠近，暴露出其催化口袋（图4）。因此，target RNA的结合很可能可以激发Csx29蛋白酶活性，从而与Cas7-11协同抵抗外源核酸的入侵。该团队关于Csx29蛋白酶活性的测定及切割底物的鉴定等后续工作也证实了这一推断（该部分研究工作正在under revision）。

图4 Csx29未结合targetRNA和结合targetRNA时的构象变化

该研究阐述了Cas7-11加工成熟pre-crRNA和切割target RNA的机制，以及Cas7-11对Csx29活性的调控机制（图5）。该研究极大地促进了人们对于CRISPR系统的理解，并为Cas7-11作为安全高效靶向RNA编辑工具的工程化改造提供了结构基础。同时该系统所具有的RNA指导的蛋白酶活性可能为生命科学研究带来新的视角和新的工具。

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