自然子课题:揭示人葡萄糖转运蛋白SGLT1的抑制机制

来源：北京大学2022-11-21 18336019

钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)是人体内负责葡萄糖重吸收的重要转运蛋白，它可以利用钠离子的电化学势反向浓度梯度转运葡萄糖。

钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)是人体内负责葡萄糖重吸收的重要转运蛋白，它可以利用钠离子的电化学势反向浓度梯度转运葡萄糖。在人体的SGLT蛋白中，SGLT1和SGLT2是葡萄糖吸收和体内平衡最关键的蛋白。其中，SGLT1由SLC5A1基因编码，主要在小肠和肾脏的近曲小管S3段表达。负责肠道内食源性葡萄糖和原尿中残留葡萄糖的重吸收，还具有水通道的功能。SGLT1失活突变会导致肠道葡萄糖-半乳糖吸收不良1；Sgt2由SLC5A2基因编码，主要在肾脏近曲小管的S1和S2段表达，负责原尿中90%的葡萄糖重吸收2。Sgt2失活突变会导致家族性肾性尿糖2，3。

作为II型治疗的重要靶点，使用SGLT2抑制剂治疗糖尿病的思路是抑制SGLT2的糖转运功能，使SGLT2不能从原尿中重吸收葡萄糖，导致多余的葡萄糖从尿中排出，达到间接健康。许多SGLT2抑制剂，如Empagliflozin、Canagliflozin和Dapagliflozin)6，已被开发用于II型糖尿病的临床治疗。此外，最近的临床试验表明，同时抑制SGLT1和SGLT2可能比单独使用SGLT2抑制剂在治疗II型糖尿病方面更有优势，并且靶向SGLT1的抑制剂也具有治疗便秘的作用。

SGLT抑制剂是根据天然产物根皮苷的结构优化的。根据其选择性，这些抑制剂可分为三类：SGLT2特异性抑制剂，如恩帕格列嗪、卡那格列嗪、达格列嗪等。SGT1特异性抑制剂，如KGA-2727、咪唑立夫嗪和SGLT1-SGLT2非选择性抑制剂，如LX2761、索他立夫嗪等。因此，了解这些药物如何抑制SGLT的功能对于药物开发和优化具有重要意义。

2021年12月，北京大学未来技术学院分子医学研究所和北京大学-清华生命科学联合中心陈雷研究员研究组在Nature杂志上首次报道了人类SGLT2-MAP17复合物与抑制剂Englising结合的结构9。同时，美国斯坦福大学冯亮研究组也在同一期刊上发表了无配体结合状态且向内开放的人SGLT1的结构10。然而，SGLT1与抑制剂结合的方式以及一些SGLT1特异性抑制剂的选择机制仍然未知。

陈雷的研究团队发表了一篇名为《自然通讯》(Nature Communications)的研究论文，通过单粒子冷冻显微镜分析了人类SGLT1-MAP17复合物结合抑制剂LX2761的高分辨率结构。

图一。sglt1与MAP17的相互作用及其复合物的电子密度图

SGLT1的分子量与SGLT2接近，序列相似度高，因此单独分析SGLT1蛋白的结构具有挑战性。作者发现SGLT1和SGLT2的TM13上与MAP17相互作用的氨基酸高度一致，推测SGLT1也可能与MAP17形成复合物。随后，这一猜想被实验证实。在此基础上，作者利用在分析SGLT2结构中发明的三接头策略，分析了SGLT1的结构：在SGLT1的胞内区域融合了GFP，在MAP17的胞内末端11融合了GFP纳米抗体，得到了一种具有功能且适用于冷冻电镜的蛋白质。作者通过低温电子显微镜下的单颗粒分析，分析了人SGLT1-MAP17复合物与抑制剂LX2761结合状态的高分辨率结构(图1)。

通过结构对比，发现SGLT1和SGLT2在结构和拓扑上非常相似。与没有配体结合的SGLT1不同，抑制剂LX2761将SGLT1锁定在向外开放的构象中(图2)。LX2761的糖基头与SGLT1的底物结合位点结合，通过疏水相互作用与底物结合位点的氨基酸相互作用。长链尾部向外延伸，堵住胞外结构域的通道入口。作者将SGLT1的L274和D454分别突变为丙氨酸，发现突变的SGLT2降低了与抑制剂的结合，减弱了抑制剂的抑制作用。

图二。抑制剂LX2761的结合位点

为了解释SGLT1的特异性抑制剂咪唑立夫嗪的选择机制，作者比较了SGLT1和SGLT2的抑制剂结合口袋，发现SGLT1的结合口袋略大于SGLT2，这种差异来自于SGLT1的第160位氨基酸的差异：SGLT1的第160位丙氨酸对应于SGLT2的第157位缬氨酸。用分子动力学模拟方法模拟了咪唑立夫嗪与SGLT1的结合方式，并将模拟结果与SGLT2的结构进行了比较。结果

发现，由于LX2761的中央苯环基团被mizagliflozin的异丙基吡唑基取代，在SGLT2的V157位氨基酸处形成了空间冲突，这可能导致了mizagliflozin对SGLT2的效力降低。因此，作者分别构建了SGLT1的A160V和SGLT2的V157A突变体，发现在SGLT1中将A突变为V会降低mizagliflozin的效力，而在SGLT2中将V突变为A则会提高mizagliflozin的效力。因此，作者鉴定了SGLT1的A160为影响Mizagliflozin选择性的主要位点之一。

同时，由于SGLT1也可以作为水通道发挥作用，作者也对抑制状态下的SGLT1结构进行了水通道的计算，结果发现在被抑制剂抑制的状态下，SGLT1中的水通道也被LX2761所阻塞，其通道大小无法通过水分子。

结合先前发表的无配体结合状态的SGLT1的结构，作者也将向内开放的SGLT1与向外开放的SGLT1结构进行了比对，描绘了SGLT1在开放和关闭状态之间的构象变化。其中，作者发现有些螺旋的位置基本不发生变化，即TM1，2，6，7，11，12，13，作者把这些螺旋命名为恒定模块（constant module）；其他螺旋则发生较大的构象变化，包括TM0，3，4，5，8，9，10，这些螺旋被命名为运动模块（moving module）。其中，TM10上F453的运动介导了胞外门控的开放，TM3上的Y290介导了胞内门控的开放。

综上所述，作者通过冷冻电镜对SGLT1-MAP17复合物和抑制剂的结构进行解析，发现抑制剂将SGLT1锁定在向外开放状态，确定了SGLT1抑制剂的结合位点和结合模式，在一定程度上解释了SGLT1选择性抑制剂的机制，为进一步优化SGLT1和SGLT2特异性抑制剂提供了结构基础。

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