Nature：肝脏微环境的奥秘：Plexin B2如何成为肿瘤转移的“帮凶”

按细胞数量计，肝细胞占肝脏的60%，按质量计则占肝脏的80%。可以想见，早期与这些细胞的相互作用可能会影响外渗的DTC形成转移灶的能力。为了验证这一点，本文研究人员开发了一种实验策略，用于在接种过程中对肝细胞-肿瘤相互作用进行汇集性地干扰。首先，利用CRISPR介导的转录激活（CRISPR-a）在肝细胞中稳定地过表达数百个基因，从而形成包含多个受扰环境的 马赛克肝脏 ；然后，通过脾内注射将肿瘤细胞输送到肝脏。此时，与过表达播种促进因子的肝细胞相互作用的DTC会定植并生长，而与过表达抑制因子的肝细胞相互作用的DTC将无法形成转移。

因此，干扰对播种的影响就可以通过相应的sgRNA在转移或非转移区域的富集来推断，其分别代表着促进或抑制播种的作用，即使没有直接观察到受干扰的播种事件，也可以通过转移的存在来回顾性评估其结果（图1）。注射一周后，利用荧光激活细胞分选（FACS）分离CD31- CD45- GFP+肝细胞，并从基因组DNA中进行靶向sgRNA扩增，然后进行测序。

图1 筛选方法的示意图(Credit: Nature)

本文研究人员利用独立扩增的sgRNA文库批次进行了三次筛选实验，发现神经营养因子很有可能是肝脏转移种植的促进因子。随后，研究人员利用具有广泛肿瘤-肝脏边界的人结直肠癌肝转移的空间转录组学数据，结合已发表的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行细胞类型反卷积，同时结合突变数据分析，证明了该筛选平台能够捕获疾病相关的相互作用，并提示肝细胞衍生的趋化因子（hepatocyte-derived chemoattractants）和轴突引导信号（axon guidance cues）是肝脏转移定植的调节因子，其中plexin B2可能参与了肝细胞和转移细胞之间的直接相互作用。

Plexin B2在大多数小鼠组织的上皮细胞中广泛表达，定位于基底侧膜。利用腺相关病毒 8（AAV8）将靶向Plxnb2的sgRNA广泛递送至小鼠肝细胞，与筛选结果一致，plexin B2过表达可以促进转移，且其促进播种的作用适用于多种经常转移到肝脏的癌症；相反，plexin B2的缺失则阻止了肝转移瘤的转移性生长。研究人员还发现，在稳定状态下，plexin B2在肝细胞中广泛表达，在门管区表达较高。值得一提的是，尽管plexin B2反应性在肿瘤周围肝细胞中较高，但其在患有CRC的小鼠肝脏中的表达没有改变，表明plexin B2不是由原发性肿瘤分泌因子或全身作用上调的，而是由于对肝转移存在的局部反应。肿瘤周围肝细胞中plexin B2的存在是转移播种所必需的，但不是维持生长所必需的。组织学分析显示，肝脏plexin B2的水平显著改变了CRC转移灶的形态和微环境，但实验结果显示，转移性的增加不是由于plexin B2过表达诱导的肝脏环境的改变，而是直接引起肿瘤-肝细胞的相互作用。

进一步对plexin B2控制肝脏定植的机制进行研究，实验结果显示肝细胞源性plexin B2是CRC肝转移上皮化的诱导因子，EMT的逆转是DTC定植和适应肝脏环境所必需的。与此同时，研究人员发现，IV类信号蛋白（plexin B2的经典配体）介导了肝细胞衍生的plexin B2对DTC的播种促进作用，高信号蛋白的表达标志着原发性肿瘤中具有较高肝转移潜力的亚群。CRC肝转移中信号蛋白的丢失与肝细胞中plexin B2的缺失具有相似的表型，证实plexin B2与肿瘤细胞上的IV类信号蛋白之间的相互作用是KLF4介导的肝转移上皮化的必要诱导因素。这些数据不仅显示了plexin B2-信号蛋白- KLF4信号在促进肝脏定植中的关键作用，也解释了不同肿瘤细胞亚群成功形成肝转移的差异能力。

综上所述，本研究结合转座子技术和荧光微环境标记，开发了一种体内CRISPR激活筛选方法，可系统地研究肝细胞和转移细胞之间的相互作用。研究结果强调了肝实质信号在DTC建立生长促进生态位之前的重要作用，也证明上皮化是CRC转移适应新组织环境所必需的，阻断Plexin-B2信号蛋白轴可消除肝脏的转移性定植，为预防肝转移提供了新的治疗策略。此外，本研究建立的筛选方法评估的是促进转移播种的能力的宿主来源的外部信号，而不是肿瘤的内在因素，因此具有广泛适用性，为筛选其他器官和癌症类型转移的环境限制奠定了方法论框架。