Nature Biotechnology：基因编辑的“瑞士军刀”！16种序列特异性编辑器诞生，实现对DNA的“按需编程”

基因 橡皮擦 的烦恼：为何总是擦错地方？

当你正在编辑一篇重要的文档，发现其中一个单词 apple 被错写成了 apcle 。你的任务是把字母 c 改成 p 。你拿起一个巨大的橡皮擦，本想只擦掉 c ，结果一不小心，把旁边的 l 和 e 也擦掉了，甚至还把 a 蹭模糊了。这番操作下来，单词非但没改对，反而变得面目全非。

这就是当前大多数碱基编辑器面临的困境，被称为 旁观者效应 (bystander editing)。

现有的碱基编辑器，无论是胞嘧啶碱基编辑器 (Cytosine Base Editors, CBEs)还是腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine Base Editors, ABEs)，它们的工作范围都不是一个精准的点，而是一个被称为 编辑窗口 (editing window)的区域，通常跨越4到10个核苷酸 (nt) 的长度。当编辑器被引导至目标位置时，它会对这个窗口内所有 符合条件 的碱基进行无差别攻击。

举个例子，在人类基因组中，某个致病突变需要将一个特定序列中的`TGC`纠正为`TGT`。我们的目标仅仅是修改那个`C`。但一个传统的CBE被带到这里时，它看到的是一个包含`C`的编辑窗口。如果这个窗口里不幸还有其他的`C`，比如序列是`ACC`，那么编辑器很可能会同时修改两个`C`，导致不希望看到的副产物。在临床应用中，这种 脱靶 的旁观者编辑是极其危险的，它可能激活癌基因、抑制抑癌基因，或导致其他意想不到的副作用，严重限制了碱基编辑技术的临床转化。

更具挑战性的是，编辑器不仅要区分目标`C`和旁观者`C`，在某些情况下，它还需要识别`C`所在的 语境 也就是它旁边的核苷酸。因为DNA序列中，平均每64个核苷酸就会出现一次任意的三核苷酸组合。如果我们能让编辑器不仅认识`C`，还能认识`C`前后的 邻居 ，比如只编辑`ACG`序列中的`C`，而不碰`TCC`或`GCT`中的`C`，那么编辑的精准度将实现质的飞跃。

然而，要打造这样具备上下文特异性 (context specificity)的编辑器，挑战巨大。自然界中虽然存在一些对特定序列有偏好的脱氨酶，但种类稀少，无法满足成千上万种不同基因编辑场景的需求。

面对这一瓶颈，研究人员决定不走寻常路。他们没有在现有的CBE上修修补补，而是选择了一个出人意料的起点，并采用了一套强大的工程策略，试图从源头上彻底解决精准度问题。

逆天改命：让只会编辑A的 酶 ，学会跟C打交道

研究人员将目光投向了一种来自大肠杆菌 (Escherichia coli)的酶，TadA。这是一个非常大胆的选择，因为TadA在自然界中的本职工作是编辑腺嘌呤 (A)，是构成高效腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 的核心元件。让一个 A编辑专家 去干 C编辑 的活，这听起来就像让一位语言学家去修航天飞机，跨界幅度极大。

但研究人员有他们的考量。TadA蛋白经过了多轮成功的定向进化，其结构和功能潜力已被广泛探索。更关键的是，他们发现某些TadA的突变体，在编辑`A`的同时，偶尔会对旁观者`C`产生微弱的 副作用 。这个微弱的信号，在他们眼中，是尚未被开垦的巨大潜力。

他们采用的核心技术是 定向进化 (directed evolution)。这是一种在实验室中模拟并加速自然选择的过程。研究人员首先会构建一个巨大的蛋白质突变文库，包含数百万种TadA的变体，每一种都有微小的差异。然后，他们设计一个巧妙的筛选系统，施加一种 生存压力 ，只有那些恰好获得了 C编辑能力 的TadA变体才能让宿主细菌在特定的中存活下来。最后，从幸存者中提取出成功的突变体，作为下一轮进化的起点，如此循环往复，直到获得性能最优的 超级酶 。

与传统的随机突变不同，研究人员采用了更具战略性的方法。他们没有胡乱地改变整个蛋白质，而是聚焦于几个已知的 核酸识别热点区域 (nucleic-acid-recognition hotspots)。这些区域是蛋白质上与DNA底物直接接触的关键 触手 ，通常是一些灵活的环状结构 (loop)。他们推断，改造这些 触手 ，最有可能改变酶的识别偏好。

从 专一 到 多能 的跨界

他们的第一个目标，是让TadA学会识别胞嘧啶 (C)。他们将矛头对准了TadA蛋白的7号环 (loop 7)。这个环在结构上负责与目标碱基的-1位核苷酸（即目标碱基前一个碱基）互动，并可能控制着底物进入活性位点的 大门 。

研究人员将7号环上的5个氨基酸（残基107-111）进行了随机化，构建了一个包含约500万个变体的庞大文库。随后，他们利用一个细菌筛选系统进行 大浪淘沙 。该系统中，一个负责氯霉素抗性的基因因为一个关键的`T:A`到`C:G`的转换而失效。只有当TadA变体能成功地将这个`C`编辑回`T`，细菌才能获得抗性并存活。

经过筛选，存活下来的细菌体内的TadA变体表现出了惊人的序列趋同性。在107-111位点，原本随机的氨基酸组合，几乎全部收敛为`PYLRM`或`RYLRM`等几种特定模式。研究人员挑选了其中几个表现优异的变体，如`TadAc1.1`和`TadAc1.2`，发现它们不仅获得了强大的C编辑能力，还保留了原有的A编辑能力。

在人胚肾细胞 (HEK293T cells) 中的测试数据证实了这一点。这些新创造的 多能 编辑器 (multipotent deaminases)，在6个不同的基因组位点上，均能高效地催化C:G到T:A和A:T到G:C的转换。例如，`TadAc1.1`在编辑窗口内对胞嘧啶的平均编辑效率达到了48.6% 22.6%，对腺嘌呤的编辑效率则为53.3% 25.2%。这意味着，通过仅仅改造一个识别热点，研究人员成功地将TadA的底物范围从单一的腺嘌呤，拓宽到了腺嘌呤和胞嘧啶两者，迈出了革命性的第一步。

从 全能选手 到 专一工匠 ：如何戒掉编辑A的 瘾 ？

虽然 多能 编辑器本身就是一个有趣的工具，但对于追求极致精准的C编辑而言，其残留的A编辑活性成了一个必须被清除的 副作用 。研究人员的目标是打造纯粹的、专一的CBE，而非CBE和ABE的混合体。

这一次，他们将目光转向了另一个关键的识别热点 3号环 (loop 3)。这个区域直接与目标碱基的+1位核苷酸（即目标碱基后一个碱基）相互作用。他们的假设是，通过改造3号环，可以彻底切断TadA与腺嘌呤的 旧情 ，让它 专一 地爱上胞嘧啶。

为此，他们设计了更为严苛的筛选系统。在这个系统中，抗性基因不仅需要C编辑来激活，同时，如果发生A编辑，反而会导致基因功能受损（例如，将一个高效的起始密码子`ACG`编辑成低效的`GTG`），从而对A编辑活性施加负向选择压力 (negative selection pressure)。这种 奖罚分明 的机制，能更有效地筛选出 专一 的C编辑器。

他们以第一轮进化中获得的多能编辑器为起点，对3号环的5个氨基酸（残基26-30）进行了随机化，并进行了第二轮和第三轮的定向进化。

进化结果不负众望。研究人员分离出了一系列几乎完全丧失A编辑活性的高效C编辑器，其中代表性的如`Tad-CBE3.1`、`Tad-CBE3.2`和`Tad-CBE3.6`。在对14个不同基因组位点的全面测试中，这些新编辑器的表现令人惊叹。

以`Tad-CBE3.1`为例，它在编辑窗口（4-8位）内，对胞嘧啶的平均编辑效率高达50.6% 14.0%，与一些顶尖的TadA衍生CBEs（如TadCBEd的54.8%）相当，甚至优于经典的rAPOBEC1-BE4（35.6%）。最关键的是，它的A编辑活性被成功抑制。在相同的编辑窗口内，其平均腺嘌呤编辑效率仅为0.3% 0.2%，几乎与背景噪音无异。

为了更直观地衡量其 专一性 ，研究人员定义了一个核苷酸特异性(nucleotide specificity)指标，即目标胞嘧啶与旁观者腺嘌呤的编辑效率比值。`Tad-CBE3.1`的这个比值高达185.0，而之前报道的一些双功能编辑器TadCBEd仅为6.8。更引人注目的是，`Tad-CBE3.1`的专一性与天然的、本身不编辑腺嘌呤的CBE（如rAPOBEC1-BE4的156.4和PpAPOBEC1-BE4的175.3）处于同一水平。

这一结果意义重大。它证明了通过系统性地改造核酸识别热点，完全可以将一个腺嘌呤脱氨酶，彻底改造为一个功能强大且高度专一的胞嘧啶脱氨酶。TadA的 命运 被彻底改写了。

终极挑战：让编辑器学会精准识别上下文！

至此，研究人员已经拥有了一把不会误伤腺嘌呤的 C编辑专用橡皮擦 。但他们并未止步，因为终极目标是打造一把能识别上下文的 高精度手术刀 。也就是说，不仅要编辑`C`，还要能精准识别`NCN`（N代表任意A, T, C, G碱基）序列中的那个`C`。

在之前的筛选中，研究人员无意中发现，当筛选`ACG`序列时，得到的`TadAc2.4`变体表现出对`AC`上下文的偏好。这一发现点燃了他们的希望：上下文特异性是可以通过定向进化来编程的！

为了系统性地实现这一目标，他们制定了一个更大胆的计划：同时对多个核酸识别热点进行组合进化。他们选定了三个关键区域：1.3号环 (loop 3, 残基26-28)，主要负责识别+1位的核苷酸；2.2号螺旋 (helix 2, 残基46-51)，同样与+1位核苷酸有相互作用；以及3.7号环 (loop 7, 残基107-111)，主要负责识别-1位的核苷酸。

他们为16种`NCN`上下文中的每一种（除`ACG`外，共15种）都设计了独特的细菌筛选质粒。在这些质粒中，只有当编辑器精准地编辑目标`NCN`序列中的那个`C`，而不编辑或少编辑其紧邻的旁观者`C`时（例如在`ACC`或`CCC`这样的连续胞嘧啶序列中），抗生素抗性基因才能被正确激活。

打造基因编辑的 瑞士军刀

研究人员并行开展了15场独立的进化 战役 ，每一场都旨在 驯化 出一种针对特定`NCN`上下文的脱氨酶。每一场 战役 都始于一个包含数千万个变体的巨大文库，这些变体的三个识别热点区域都被随机化了。

这个过程产生了海量的、功能强大的上下文特异性脱氨酶。研究人员从每个进化活动中挑选了2-6个优胜者进行深入分析，结果令人振奋。

以`ACC`上下文的进化为例，这是一个极具挑战性的目标，因为它包含两个连续的`C`。传统的CBE很难区分它们。在筛选`ACC`的实验中，研究人员发现，虽然对照组的`TadAc2.4`也能编辑这个位点，但其编辑纯度(editing purity) 只有0.42，这意味着它有近60%的概率会错误地编辑第一个`A``C``C`中的`C`，或同时编辑两个`C`。而新进化出的`TadA(ACC2)`变体，其编辑纯度飙升至0.97，几乎只精准地编辑第二个`C`，对第一个`C`几乎 视而不见 。

同样，在`TCA`上下文的进化中，新得到的`TadA(TCA3)`在体外实验中表现出惊人的特异性。当研究人员用它处理一个含有5386个核苷酸的病毒DNA时，它在79个`TCA`位点上的平均编辑效率高达82.4%。而对于仅有一个 邻居 匹配的`TCN`和`NCA`位点，其活性显著下降（分别为28.5%和59.2%）。对于上下文完全不匹配的`VCT`或`VCC`位点，其活性则降至冰点（平均低于9%）。

最终，研究人员成功构建了一个包含16种上下文特异性脱氨酶 (TadAc(NCN))的完整工具箱，涵盖了所有`NCN`组合。这套工具箱就像一把基因编辑领域的 瑞士军刀 ，为各种复杂的编辑任务提供了按需定制的解决方案。

实战演练：用 狙击手 工具箱修正遗传病、模拟癌症

拥有了这套强大的 狙击枪 工具箱后，研究人员立刻将其投入了最接近真实应用的 战场 ，以检验它们的实战能力。

大规模修正人类遗传病突变

研究人员构建了一个前所未有的高通量测试平台。他们从ClinVar数据库（一个权威的人类遗传变异与临床表型数据库）中，挑选了10,099个与人类疾病相关的、可以通过CBE修正的致病性`T:A`到`C:G`转换。然后，他们将这些突变位点及其周围的天然基因组序列，与对应的sgRNA配对，构建了一个巨大的配对sgRNA-靶点文库 (paired sgRNA-target library)，并将其稳定整合到HEK293T细胞中。

这个巧妙的设计，使得他们可以在一次实验中，平行评估16种新的上下文特异性Tad-CBEs以及4种顶尖的常规CBEs（Tad-CBE2.4, Tad-CBE3.1, TadCBEd, rAPOBEC1-BE4），在数千个真实疾病位点上的编辑表现。

分析结果堪称一场 大胜 。在总共7,196个被成功测序的疾病位点中，研究人员的上下文特异性Tad-CBEs在其中的5,866个位点上（占比高达81.5%），展现出比所有四种对照编辑器都更高的编辑精度（即目标编辑效率与旁观者编辑效率的比值）。

尤其是在处理那些带有旁观者胞嘧啶的棘手位点时，新工具的优势尽显。在位于编辑窗口核心位置（5-7位）的2,046个疾病位点中，上下文特异性编辑器在416个位点上实现了完全无旁观者编辑的 完美修复 。相比之下，性能强大的Tad-CBE2.4只在59个位点做到了这一点，而经典的rAPOBEC1-BE4更是只有62个。这表明，在需要极致精准的场景下，按需选择的上下文特异性编辑器，其表现远超传统 一刀切 的编辑器。

精准模拟癌症驱动突变

除了修正疾病，精准地 制造 疾病模型同样至关重要，尤其是在癌症研究和药物开发中。许多癌症的发生，源于DNA上一个或几个关键碱基的突变。

研究人员选择了两个臭名昭著的癌症 元凶 进行挑战：1.KRAS G12D (ACC)：这是最常见的致癌突变之一，存在于多种癌症中。它的挑战在于，需要精准地将`ACC`序列中的第二个`C`突变成`T`，而第一个`C`必须保持不变。任何对第一个`C`的编辑都会导致错误的、非G12D的突变。2.TP53 R248Q (CCG)：这是一个关键的抑癌基因`TP53`的热点突变。挑战与KRAS类似，需要精准编辑`CCG`中的第二个`C`。

为了模拟真实应用场景，研究人员使用了mRNA递送的方式，并将编辑器与更灵活的SpRY-Cas9（它对PAM序列的要求更宽松）结合，在更难编辑的人类肺成纤维细胞 (IMR-90) 中进行实验。

实验结果清晰地展示了 狙击枪 与 散弹枪 的区别。

在模拟KRAS G12D时：使用针对`ACC`上下文优化的`SpRY-Tad-CBE(ACC3)`，总编辑产物中有21.1%是研究人员想要的、纯净的`G12D`突变。而使用强大的常规编辑器`SpRY-Tad-CBE2.4`，尽管其总编辑活性可能更高，但最终产生的纯净`G12D`突变仅占2.9%，绝大多数产物都是包含了旁观者编辑的 废品 。经典的`SpRY-rAPOBEC1-BE4`甚至完全无法产生正确的产物（0%）。

在模拟TP53 R248Q时，结果同样显著：使用针对`CCG`优化的`SpRY-Tad-CBE(CCG3)`，成功地获得了18.5%的纯净`R248Q`突变。而`SpRY-Tad-CBE2.4`和`SpRY-TadCBEd`产生的正确产物分别只有1.6%和4.4%。

这些数据证明，上下文特异性Tad-CBEs能够以传统编辑器无法企及的精度，在细胞内精准地安装特定的点突变，为构建高保真的癌症模型，以及未来开发更安全的基因疗法，提供了前所未有的强大工具。

这把 手术刀 将带我们去向何方？

这项发表在《自然 生物技术》上的研究，不仅仅是创造了一套包含16个新工具的 基因编辑工具箱 ，更重要的是，它提供了一套行之有效的通用策略 (general strategy)，为未来设计功能更多样、性能更强大的蛋白质机器，绘制了一幅清晰的蓝图。

通过聚焦于蛋白质上的 核酸识别热点区域 进行定向进化，研究人员展示了一种高效、可预测的蛋白质工程方法。它告诉我们，蛋白质的功能，尤其是与核酸的相互作用，是可以在分子层面被精细 编程 的。这种 编程 思想，未来可以被应用到其他类型的酶上，例如DNA修复蛋白、甲基化酶等，从而解锁更多样的生命调控手段。

对于基因治疗领域，这项工作的意义不言而喻。更高的精准度意味着更低的脱靶风险和更高的安全性。许多因为旁观者效应而被搁置的潜在治疗靶点，现在有了被重新审视和开发的机会。我们可以想象，在未来，医生可以根据患者的具体基因突变（例如，一个位于`TCA`上下文的突变），从工具箱中选择对应的`Tad-CBE(TCA)`编辑器，进行 个性化 的精准治疗。

对于基础研究，这套工具箱则极大地提升了我们探究生命奥秘的能力。通过精准地在细胞或动物模型中引入特定的点突变，研究人员可以更清晰地解析基因功能、信号通路和疾病发生机制，而无需担心旁观者突变带来的 噪音 干扰实验结果。

当然，从实验室的成功到临床的广泛应用，依然有很长的路要走，例如如何将这些大型蛋白质编辑器安全、高效地递送到体内的特定组织和细胞，仍然是整个领域面临的共同挑战。但毫无疑问，这项工作为基因编辑的精准度设立了新的标杆，它将一把粗糙的 斧头 ，精心打磨成了一把锋利而精准的 手术刀 ，让我们在 书写 生命密码时，笔触更加细腻，未来更加可期。

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