Nature Biotechnology:基因编辑的“瑞士军刀”!16种序列特异性编辑器诞生,实现对DNA的“按需编程” |
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基因 橡皮擦 的烦恼:为何总是擦错地方?
当你正在编辑一篇重要的文档,发现其中一个单词 apple 被错写成了 apcle 。你的任务是把字母 c 改成 p 。你拿起一个巨大的橡皮擦,本想只擦掉 c ,结果一不小心,把旁边的 l 和 e 也擦掉了,甚至还把 a 蹭模糊了。这番操作下来,单词非但没改对,反而变得面目全非。
这就是当前大多数碱基编辑器面临的困境,被称为 旁观者效应 (bystander editing)。
现有的碱基编辑器,无论是胞嘧啶碱基编辑器 (Cytosine Base Editors, CBEs)还是腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine Base Editors, ABEs),它们的工作范围都不是一个精准的点,而是一个被称为 编辑窗口 (editing window)的区域,通常跨越4到10个核苷酸 (nt) 的长度。当编辑器被引导至目标位置时,它会对这个窗口内所有 符合条件 的碱基进行无差别攻击。
举个例子,在人类基因组中,某个致病突变需要将一个特定序列中的`TGC`纠正为`TGT`。我们的目标仅仅是修改那个`C`。但一个传统的CBE被带到这里时,它看到的是一个包含`C`的编辑窗口。如果这个窗口里不幸还有其他的`C`,比如序列是`ACC`,那么编辑器很可能会同时修改两个`C`,导致不希望看到的副产物。在临床应用中,这种 脱靶 的旁观者编辑是极其危险的,它可能激活癌基因、抑制抑癌基因,或导致其他意想不到的副作用,严重限制了碱基编辑技术的临床转化。
更具挑战性的是,编辑器不仅要区分目标`C`和旁观者`C`,在某些情况下,它还需要识别`C`所在的 语境 也就是它旁边的核苷酸。因为DNA序列中,平均每64个核苷酸就会出现一次任意的三核苷酸组合。如果我们能让编辑器不仅认识`C`,还能认识`C`前后的 邻居 ,比如只编辑`ACG`序列中的`C`,而不碰`TCC`或`GCT`中的`C`,那么编辑的精准度将实现质的飞跃。
然而,要打造这样具备上下文特异性 (context specificity)的编辑器,挑战巨大。自然界中虽然存在一些对特定序列有偏好的脱氨酶,但种类稀少,无法满足成千上万种不同基因编辑场景的需求。
面对这一瓶颈,研究人员决定不走寻常路。他们没有在现有的CBE上修修补补,而是选择了一个出人意料的起点,并采用了一套强大的工程策略,试图从源头上彻底解决精准度问题。
逆天改命:让只会编辑A的 酶 ,学会跟C打交道
研究人员将目光投向了一种来自大肠杆菌 (Escherichia coli)的酶,TadA。这是一个非常大胆的选择,因为TadA在自然界中的本职工作是编辑腺嘌呤 (A),是构成高效腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 的核心元件。让一个 A编辑专家 去干 C编辑 的活,这听起来就像让一位语言学家去修航天飞机,跨界幅度极大。
但研究人员有他们的考量。TadA蛋白经过了多轮成功的定向进化,其结构和功能潜力已被广泛探索。更关键的是,他们发现某些TadA的突变体,在编辑`A`的同时,偶尔会对旁观者`C`产生微弱的 副作用 。这个微弱的信号,在他们眼中,是尚未被开垦的巨大潜力。
他们采用的核心技术是 定向进化 (directed evolution)。这是一种在实验室中模拟并加速自然选择的过程。研究人员首先会构建一个巨大的蛋白质突变文库,包含数百万种TadA的变体,每一种都有微小的差异。然后,他们设计一个巧妙的筛选系统,施加一种 生存压力 ,只有那些恰好获得了 C编辑能力 的TadA变体才能让宿主细菌在特定的中存活下来。最后,从幸存者中提取出成功的突变体,作为下一轮进化的起点,如此循环往复,直到获得性能最优的 超级酶 。
与传统的随机突变不同,研究人员采用了更具战略性的方法。他们没有胡乱地改变整个蛋白质,而是聚焦于几个已知的 核酸识别热点区域 (nucleic-acid-recognition hotspots)。这些区域是蛋白质上与DNA底物直接接触的关键 触手 ,通常是一些灵活的环状结构 (loop)。他们推断,改造这些 触手 ,最有可能改变酶的识别偏好。
从 专一 到 多能 的跨界
他们的第一个目标,是让TadA学会识别胞嘧啶 (C)。他们将矛头对准了TadA蛋白的7号环 (loop 7)。这个环在结构上负责与目标碱基的-1位核苷酸(即目标碱基前一个碱基)互动,并可能控制着底物进入活性位点的 大门 。
研究人员将7号环上的5个氨基酸(残基107-111)进行了随机化,构建了一个包含约500万个变体的庞大文库。随后,他们利用一个细菌筛选系统进行 大浪淘沙 。该系统中,一个负责氯霉素抗性的基因因为一个关键的`T:A`到`C:G`的转换而失效。只有当TadA变体能成功地将这个`C`编辑回`T`,细菌才能获得抗性并存活。
经过筛选,存活下来的细菌体内的TadA变体表现出了惊人的序列趋同性。在107-111位点,原本随机的氨基酸组合,几乎全部收敛为`PYLRM`或`RYLRM`等几种特定模式。研究人员挑选了其中几个表现优异的变体,如`TadAc1.1`和`TadAc1.2`,发现它们不仅获得了强大的C编辑能力,还保留了原有的A编辑能力。
在人胚肾细胞 (HEK293T cells) 中的测试数据证实了这一点。这些新创造的 多能 编辑器 (multipotent deaminases),在6个不同的基因组位点上,均能高效地催化C:G到T:A和A:T到G:C的转换。例如,`TadAc1.1`在编辑窗口内对胞嘧啶的平均编辑效率达到了48.6% 22.6%,对腺嘌呤的编辑效率则为53.3% 25.2%。这意味着,通过仅仅改造一个识别热点,研究人员成功地将TadA的底物范围从单一的腺嘌呤,拓宽到了腺嘌呤和胞嘧啶两者,迈出了革命性的第一步。
从 全能选手 到 专一工匠 :如何戒掉编辑A的 瘾 ?
虽然 多能 编辑器本身就是一个有趣的工具,但对于追求极致精准的C编辑而言,其残留的A编辑活性成了一个必须被清除的 副作用 。研究人员的目标是打造纯粹的、专一的CBE,而非CBE和ABE的混合体。
这一次,他们将目光转向了另一个关键的识别热点 3号环 (loop 3)。这个区域直接与目标碱基的+1位核苷酸(即目标碱基后一个碱基)相互作用。他们的假设是,通过改造3号环,可以彻底切断TadA与腺嘌呤的 旧情 ,让它 专一 地爱上胞嘧啶。
为此,他们设计了更为严苛的筛选系统。在这个系统中,抗性基因不仅需要C编辑来激活,同时,如果发生A编辑,反而会导致基因功能受损(例如,将一个高效的起始密码子`ACG`编辑成低效的`GTG`),从而对A编辑活性施加负向选择压力 (negative selection pressure)。这种 奖罚分明 的机制,能更有效地筛选出 专一 的C编辑器。
他们以第一轮进化中获得的多能编辑器为起点,对3号环的5个氨基酸(残基26-30)进行了随机化,并进行了第二轮和第三轮的定向进化。
进化结果不负众望。研究人员分离出了一系列几乎完全丧失A编辑活性的高效C编辑器,其中代表性的如`Tad-CBE3.1`、`Tad-CBE3.2`和`Tad-CBE3.6`。在对14个不同基因组位点的全面测试中,这些新编辑器的表现令人惊叹。
以`Tad-CBE3.1`为例,它在编辑窗口(4-8位)内,对胞嘧啶的平均编辑效率高达50.6% 14.0%,与一些顶尖的TadA衍生CBEs(如TadCBEd的54.8%)相当,甚至优于经典的rAPOBEC1-BE4(35.6%)。最关键的是,它的A编辑活性被成功抑制。在相同的编辑窗口内,其平均腺嘌呤编辑效率仅为0.3% 0.2%,几乎与背景噪音无异。
为了更直观地衡量其 专一性 ,研究人员定义了一个核苷酸特异性(nucleotide specificity)指标,即目标胞嘧啶与旁观者腺嘌呤的编辑效率比值。`Tad-CBE3.1`的这个比值高达185.0,而之前报道的一些双功能编辑器TadCBEd仅为6.8。更引人注目的是,`Tad-CBE3.1`的专一性与天然的、本身不编辑腺嘌呤的CBE(如rAPOBEC1-BE4的156.4和PpAPOBEC1-BE4的175.3)处于同一水平。
这一结果意义重大。它证明了通过系统性地改造核酸识别热点,完全可以将一个腺嘌呤脱氨酶,彻底改造为一个功能强大且高度专一的胞嘧啶脱氨酶。TadA的 命运 被彻底改写了。
终极挑战:让编辑器学会精准识别上下文!
至此,研究人员已经拥有了一把不会误伤腺嘌呤的 C编辑专用橡皮擦 。但他们并未止步,因为终极目标是打造一把能识别上下文的 高精度手术刀 。也就是说,不仅要编辑`C`,还要能精准识别`NCN`(N代表任意A, T, C, G碱基)序列中的那个`C`。
在之前的筛选中,研究人员无意中发现,当筛选`ACG`序列时,得到的`TadAc2.4`变体表现出对`AC`上下文的偏好。这一发现点燃了他们的希望:上下文特异性是可以通过定向进化来编程的!
为了系统性地实现这一目标,他们制定了一个更大胆的计划:同时对多个核酸识别热点进行组合进化。他们选定了三个关键区域:1.3号环 (loop 3, 残基26-28),主要负责识别+1位的核苷酸;2.2号螺旋 (helix 2, 残基46-51),同样与+1位核苷酸有相互作用;以及3.7号环 (loop 7, 残基107-111),主要负责识别-1位的核苷酸。
他们为16种`NCN`上下文中的每一种(除`ACG`外,共15种)都设计了独特的细菌筛选质粒。在这些质粒中,只有当编辑器精准地编辑目标`NCN`序列中的那个`C`,而不编辑或少编辑其紧邻的旁观者`C`时(例如在`ACC`或`CCC`这样的连续胞嘧啶序列中),抗生素抗性基因才能被正确激活。
打造基因编辑的 瑞士军刀
研究人员并行开展了15场独立的进化 战役 ,每一场都旨在 驯化 出一种针对特定`NCN`上下文的脱氨酶。每一场 战役 都始于一个包含数千万个变体的巨大文库,这些变体的三个识别热点区域都被随机化了。
这个过程产生了海量的、功能强大的上下文特异性脱氨酶。研究人员从每个进化活动中挑选了2-6个优胜者进行深入分析,结果令人振奋。
以`ACC`上下文的进化为例,这是一个极具挑战性的目标,因为它包含两个连续的`C`。传统的CBE很难区分它们。在筛选`ACC`的实验中,研究人员发现,虽然对照组的`TadAc2.4`也能编辑这个位点,但其编辑纯度(editing purity) 只有0.42,这意味着它有近60%的概率会错误地编辑第一个`A``C``C`中的`C`,或同时编辑两个`C`。而新进化出的`TadA(ACC2)`变体,其编辑纯度飙升至0.97,几乎只精准地编辑第二个`C`,对第一个`C`几乎 视而不见 。
同样,在`TCA`上下文的进化中,新得到的`TadA(TCA3)`在体外实验中表现出惊人的特异性。当研究人员用它处理一个含有5386个核苷酸的病毒DNA时,它在79个`TCA`位点上的平均编辑效率高达82.4%。而对于仅有一个 邻居 匹配的`TCN`和`NCA`位点,其活性显著下降(分别为28.5%和59.2%)。对于上下文完全不匹配的`VCT`或`VCC`位点,其活性则降至冰点(平均低于9%)。
最终,研究人员成功构建了一个包含16种上下文特异性脱氨酶 (TadAc(NCN))的完整工具箱,涵盖了所有`NCN`组合。这套工具箱就像一把基因编辑领域的 瑞士军刀 ,为各种复杂的编辑任务提供了按需定制的解决方案。
实战演练:用 狙击手 工具箱修正遗传病、模拟癌症
拥有了这套强大的 狙击枪 工具箱后,研究人员立刻将其投入了最接近真实应用的 战场 ,以检验它们的实战能力。
大规模修正人类遗传病突变
研究人员构建了一个前所未有的高通量测试平台。他们从ClinVar数据库(一个权威的人类遗传变异与临床表型数据库)中,挑选了10,099个与人类疾病相关的、可以通过CBE修正的致病性`T:A`到`C:G`转换。然后,他们将这些突变位点及其周围的天然基因组序列,与对应的sgRNA配对,构建了一个巨大的配对sgRNA-靶点文库 (paired sgRNA-target library),并将其稳定整合到HEK293T细胞中。
这个巧妙的设计,使得他们可以在一次实验中,平行评估16种新的上下文特异性Tad-CBEs以及4种顶尖的常规CBEs(Tad-CBE2.4, Tad-CBE3.1, TadCBEd, rAPOBEC1-BE4),在数千个真实疾病位点上的编辑表现。
分析结果堪称一场 大胜 。在总共7,196个被成功测序的疾病位点中,研究人员的上下文特异性Tad-CBEs在其中的5,866个位点上(占比高达81.5%),展现出比所有四种对照编辑器都更高的编辑精度(即目标编辑效率与旁观者编辑效率的比值)。
尤其是在处理那些带有旁观者胞嘧啶的棘手位点时,新工具的优势尽显。在位于编辑窗口核心位置(5-7位)的2,046个疾病位点中,上下文特异性编辑器在416个位点上实现了完全无旁观者编辑的 完美修复 。相比之下,性能强大的Tad-CBE2.4只在59个位点做到了这一点,而经典的rAPOBEC1-BE4更是只有62个。这表明,在需要极致精准的场景下,按需选择的上下文特异性编辑器,其表现远超传统 一刀切 的编辑器。
精准模拟癌症驱动突变
除了修正疾病,精准地 制造 疾病模型同样至关重要,尤其是在癌症研究和药物开发中。许多癌症的发生,源于DNA上一个或几个关键碱基的突变。
研究人员选择了两个臭名昭著的癌症 元凶 进行挑战:1.KRAS G12D (ACC):这是最常见的致癌突变之一,存在于多种癌症中。它的挑战在于,需要精准地将`ACC`序列中的第二个`C`突变成`T`,而第一个`C`必须保持不变。任何对第一个`C`的编辑都会导致错误的、非G12D的突变。2.TP53 R248Q (CCG):这是一个关键的抑癌基因`TP53`的热点突变。挑战与KRAS类似,需要精准编辑`CCG`中的第二个`C`。
为了模拟真实应用场景,研究人员使用了mRNA递送的方式,并将编辑器与更灵活的SpRY-Cas9(它对PAM序列的要求更宽松)结合,在更难编辑的人类肺成纤维细胞 (IMR-90) 中进行实验。
实验结果清晰地展示了 狙击枪 与 散弹枪 的区别。
在模拟KRAS G12D时:使用针对`ACC`上下文优化的`SpRY-Tad-CBE(ACC3)`,总编辑产物中有21.1%是研究人员想要的、纯净的`G12D`突变。而使用强大的常规编辑器`SpRY-Tad-CBE2.4`,尽管其总编辑活性可能更高,但最终产生的纯净`G12D`突变仅占2.9%,绝大多数产物都是包含了旁观者编辑的 废品 。经典的`SpRY-rAPOBEC1-BE4`甚至完全无法产生正确的产物(0%)。
在模拟TP53 R248Q时,结果同样显著:使用针对`CCG`优化的`SpRY-Tad-CBE(CCG3)`,成功地获得了18.5%的纯净`R248Q`突变。而`SpRY-Tad-CBE2.4`和`SpRY-TadCBEd`产生的正确产物分别只有1.6%和4.4%。
这些数据证明,上下文特异性Tad-CBEs能够以传统编辑器无法企及的精度,在细胞内精准地安装特定的点突变,为构建高保真的癌症模型,以及未来开发更安全的基因疗法,提供了前所未有的强大工具。
这把 手术刀 将带我们去向何方?
这项发表在《自然 生物技术》上的研究,不仅仅是创造了一套包含16个新工具的 基因编辑工具箱 ,更重要的是,它提供了一套行之有效的通用策略 (general strategy),为未来设计功能更多样、性能更强大的蛋白质机器,绘制了一幅清晰的蓝图。
通过聚焦于蛋白质上的 核酸识别热点区域 进行定向进化,研究人员展示了一种高效、可预测的蛋白质工程方法。它告诉我们,蛋白质的功能,尤其是与核酸的相互作用,是可以在分子层面被精细 编程 的。这种 编程 思想,未来可以被应用到其他类型的酶上,例如DNA修复蛋白、甲基化酶等,从而解锁更多样的生命调控手段。
对于基因治疗领域,这项工作的意义不言而喻。更高的精准度意味着更低的脱靶风险和更高的安全性。许多因为旁观者效应而被搁置的潜在治疗靶点,现在有了被重新审视和开发的机会。我们可以想象,在未来,医生可以根据患者的具体基因突变(例如,一个位于`TCA`上下文的突变),从工具箱中选择对应的`Tad-CBE(TCA)`编辑器,进行 个性化 的精准治疗。
对于基础研究,这套工具箱则极大地提升了我们探究生命奥秘的能力。通过精准地在细胞或动物模型中引入特定的点突变,研究人员可以更清晰地解析基因功能、信号通路和疾病发生机制,而无需担心旁观者突变带来的 噪音 干扰实验结果。
当然,从实验室的成功到临床的广泛应用,依然有很长的路要走,例如如何将这些大型蛋白质编辑器安全、高效地递送到体内的特定组织和细胞,仍然是整个领域面临的共同挑战。但毫无疑问,这项工作为基因编辑的精准度设立了新的标杆,它将一把粗糙的 斧头 ,精心打磨成了一把锋利而精准的 手术刀 ,让我们在 书写 生命密码时,笔触更加细腻,未来更加可期。
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