Science：AI造“钥匙”，精准开锁癌细胞：深度学习开启蛋白设计新纪元

大海捞针：免疫疗法的 阿喀琉斯之踵

设计一种能精准识别特定pMHC-I复合物的 分子巡警 极其困难，其挑战堪比在一座巨大的图书馆里，从成千上万本封面和标题都极其相似的书中，找到唯一那本正确的书。

首先，目标肽段（比如来自癌细胞的某个突变蛋白）与细胞内成千上万种正常肽段（来自自身蛋白质）可能只有一个或两个氨基酸的差异。我们的 分子巡警 必须具备火眼金睛，能准确识别这微小的差别，否则就可能 误伤友军 ，攻击正常细胞，引发严重的、甚至致命的毒副作用。这被称为 脱靶效应 (off-target effect)。

其次，MHC分子本身也极具多样性。在人类群体中，编码MHC分子的基因（称为人类白细胞抗原，Human Leukocyte Antigen, HLA）有成千上万种不同的等位基因(alleles)。这意味着不同人的 展示窗 框架本身就不一样。一个为某位患者设计的 分子巡警 ，可能完全无法识别另一位患者细胞上的 展示窗 。

传统的两种方法都步履维艰。一种是从健康的捐赠者体内筛选天然的TCR，但这就像买彩票，能恰好找到针对特定肿瘤肽段且亲和力足够高的TCR的概率极低。另一种方法是改造抗体，让它们去识别pMHC-I，但抗体天然的结构似乎并不擅长这项任务，它们往往会过多地接触MHC分子的 框架 部分，而忽略了关键的 展示内容 肽段，导致特异性不佳。

高昂的成本、漫长的周期和极低的成功率，让pMHC-I这个充满希望的靶点，在很长一段时间里都像是一座可望而不可及的堡垒。我们需要一种全新的、更高效、更理性的设计方法。

AI作画，从混沌中创造秩序

面对这一困境，研究团队决定另辟蹊径。他们没有在现有的蛋白质（如TCR或抗体）上修修补补，而是选择了一条更大胆的道路：让AI从一张白纸开始，凭空 画 出一个全新的、理想的 分子巡警 。

他们使用的画笔，是一款名为`RFdiffusion`的生成式AI模型。这款模型在蛋白质设计领域声名鹊起，它能够在给定目标结构的情况下，从完全随机的原子坐标云开始，通过一个 去噪 过程，逐步生成一个能够与目标紧密结合的全新蛋白质骨架。这个过程，宛如一位雕塑家，从一块无定形的石料中，逐渐凿出精美的雕像。

研究人员首先将目标pMHC-I复合物的结构作为 创作主题 输入给AI。他们的要求非常明确：新设计的蛋白质（我们称之为 binder ）必须像一个拱门，优雅地跨越在MHC分子的肽结合槽之上，其接触面要主要集中在核心的肽段上，同时尽量避免与高度保守的MHC分子 框架 发生过多接触。

AI在数千次的独立 创作 中，生成了大量形态各异的蛋白质骨架。随后，研究团队动用了另外两个强大的计算工具进行筛选。首先，他们使用`ProteinMPNN`来为这些骨架 填充 上最佳的氨基酸序列，使其既能稳定折叠，又能与目标肽段产生最强的结合力。接着，他们用鼎鼎大名的`AlphaFold2`来预测这些设计出的binder是否真的能如预期那样折叠并与目标pMHC-I结合。

经过这套计算流水线的严格筛选，研究人员为11个不同的pMHC-I靶点，挑选出了最有潜力的候选binder。这11个靶点堪称一个 豪华阵容 ，它们结构多样，涵盖了不同的HLA等位基因（如`A*01:01`、`A*02:01`、`A*03:01`和`C*07:02`），所呈递的肽段则来自多种病毒（如导致非典型肺炎的SARS病毒、黄热病毒YFV、病毒HIV）和多种肿瘤（如肿瘤相关抗原WT1、PAP、以及广为人知的瘤抗原MAGE-A3）。这无疑是一场对AI设计能力的 大考 。

从虚拟到现实：实验室里的 终极试炼

计算机里的完美设计，必须在现实世界中证明自己。研究人员将编码这些AI设计binder的DNA序列合成了出来，总量高达数千到上万个不等。他们使用了一种巧妙的酵母表面展示(yeast display)技术。简单来说，就是让每个酵母细胞表面都 穿上 一种binder。

然后，他们将这些酵母 大军 与两种pMHC-I复合物混合。一种是它们应该识别的 靶心 (on-target)，被标记上了一种颜色的荧光；另一种是与靶心非常相似的 干扰项 (off-target)，被标记上另一种颜色的荧光。通过流式细胞分选术(FACS)，研究人员像在一个繁忙的十字路口指挥交通一样，只放行那些紧紧抓住 靶心 荧光，同时又对 干扰项 荧光不屑一顾的酵母细胞。

结果显示，对于绝大多数靶点，他们都成功筛选出了高度特异性的binder。以一个靶向黄热病毒(YFV)肽段的binder`yfv-2`为例，酵母展示实验的数据显示，与靶向pMHC-I复合物结合的细胞群体比例高达88.8%，而与一种高度相似的脱靶pMHC-I复合物结合的细胞比例仅为6.96%。这种清晰的信号分离，证明了AI设计的binder具有极高的特异性。

为了进一步验证设计的准确性，研究人员还成功解析了一个名为`mart1-3`的binder与其靶向的抗原MART-1 pMHC-I复合物的共晶结构，分辨率达到了2.2埃。当他们将真实的晶体结构与AI最初的设计模型进行比对时，两者几乎完美重合，其骨架的均方根偏差(C RMSD)仅有0.4埃 这是一个小到可以忽略不计的数值。这有力地证明了，AI不仅 画 出了一个能用的binder，而且它对这个binder如何工作的每一个细节都 看 得清清楚楚。

激活 沉睡的哨兵 ：从结合到功能的飞跃

一个合格的 分子巡警 不仅要能 认出 敌人，更关键的是要能 拉响警报 ，激活免疫细胞。为了检验这些binder是否具备这项核心功能，研究人员将它们的编码序列整合进了CAR的结构中，并把这些定制版的CAR表达在一种名为Jurkat的T细胞系表面。

他们以一个靶向MAGE-A3肿瘤抗原的binder`mage-513`作为范例，进行了一系列巧妙的细胞实验。MAGE-A3是一种在多种肿瘤中表达，但在正常组织中几乎不存在的蛋白质，是理想的靶点。然而，人体内的一种名为Titin的蛋白质，其降解后产生的肽段与MAGE-A3的靶向肽段(EVDPIGHLY)只有一个氨基酸的差异，是极具挑战性的 干扰项 。

实验结果显示，当表达`mage-513`CAR的Jurkat细胞与装载了MAGE-A3肽段的靶细胞共培养时，T细胞被强烈激活，其表面的激活标志物CD69的阳性率飙升至47.6%。相比之下，当靶细胞装载的是 干扰项 Titin肽段时，CD69阳性率仅为1.08%，与未加任何肽段的对照组（1.12%）几乎没有差别。

这一结果清晰地表明，`mage-513`CAR具备了极其精准的识别能力，能够有效地区分 敌我 ，只在遇到真正的肿瘤 信号 时才会拉响警报。这正是免疫治疗追求的 圣杯 高效且安全。

解码特异性：深入分子内部的 对话

`mage-513`为何如此 聪明 ？AI在设计它的时候，到底赋予了它怎样的 智慧 ？借助计算机模型和进一步的实验，研究人员得以一探究竟。

设计模型显示，`mage-513`与MAGE-A3肽段之间形成了一个复杂而精密的相互作用网络。Binder的L37和L86残基形成了一个疏水性口袋，紧紧包裹住肽段的L8残基；同时，binder还与肽段的H7和L8残基的主链和侧链形成了多个氢键。这些相互作用力，如同一把精密的锁与钥匙，确保了连接的紧密与特异。

为了验证这些 对话 的重要性，研究人员进行了一系列 定点打击 丙氨酸扫描(alanine scanning)。他们将肽段上或binder上参与相互作用的关键氨基酸，逐一突变成没有特殊功能的丙氨酸，然后观察T细胞的激活情况。

结果与设计模型高度吻合。当肽段上与binder接触最紧密的I5、H7或L8被突变后，T细胞的激活水平急剧下降。同样，当binder上的关键残基L37、D40或L86被突变后，激活能力也显著减弱。

更有趣的是，研究人员发现binder上有一个名为D29的残基。在设计模型中，它虽然离肽段很近，但并未直接接触。研究人员推测，它可能扮演着 守门员 (gatekeeper)的角色。它的存在，可能会与那些在相应位置(P4)拥有大体积氨基酸的 干扰肽段 发生空间位阻(clashing)，从而将它们拒之门外。果不其然，当他们将D29突变后，虽然对MAGE-A3肽段的识别没有影响，但CAR-T细胞的 背景激活 水平却升高了，说明它开始对靶细胞上存在的其他自身肽段产生了不必要的反应。这位 守门员 的存在，巧妙地提升了binder的洁净度。

类似的分子 对话 也在其他binder中被发现。例如，在一个靶向WT1肿瘤抗原的binder`wt1-5`中，其E40残基与肽段的R1残基形成了一对强有力的 盐桥 氢键。而在一个靶向HIV病毒肽段的binder`hiv-9`中，则是与肽段P4和L5的疏水作用和氢键网络起到了决定性作用。AI似乎掌握了针对不同 锁孔 设计不同 齿形 的通用法则。

旧瓶装新酒，无中生有：设计的无限可能

这项研究的魅力不止于此，研究人员还向我们展示了两种更令人兴奋的可能性。

第一种是 旧瓶装新酒 利用 部分扩散 (partial diffusion)技术进行快速改造。从零开始设计一个全新的binder毕竟耗时耗力。研究人员想到，既然pMHC-I的整体结构都比较相似，那么一个成功的binder骨架，是否可以被 改造 去识别新的目标呢？

他们以一个已成功设计的binder为 毛坯 ，通过`RFdiffusion`对其进行轻微的 再创造 ，只在与肽段接触的关键区域进行重新设计。结果，他们成功地从一个旧的binder出发，快速设计出了能够特异性识别gp100、MART-1和PRAME这三种全新肿瘤抗原的binder。这就像是掌握了一个万能钥匙的模板，只需要对关键的齿形稍作修改，就能打开一把把新的锁，极大地提升了设计效率。

第二种，也是更具革命性的一点，是 无中生有 针对AI预测的结构进行设计。在现实世界中，绝大多数pMHC-I复合物的实验结构都是未知的。获取它们的晶体结构本身就是一个巨大的瓶颈。那么，我们能否直接跳过实验，针对AI预测出的pMHC-I结构进行设计呢？

研究人员勇敢地挑战了这一点。他们选择了一个重要的肿瘤靶点PRAME，其相应的pMHC-I复合物当时并没有高分辨率的实验结构。他们直接使用`AlphaFold`预测出的结构作为 设计蓝图 ，并启动了`RFdiffusion`。令人难以置信的是，他们再次取得了成功。设计出的binder`prame-9`和`prame-2`，在后续的细胞实验中，表现出了对PRAME肽段的高度特异性识别和激活能力。

这一步的意义极为深远。它意味着，未来研究人员不再受限于已知的实验结构，理论上可以为任何一个感兴趣的、由蛋白质组学鉴定出的肿瘤肽段，设计出特异性的binder。这片曾经充满迷雾的广阔疆域，如今被AI的火炬照亮了。

最后，为了证明这些AI设计的 分子巡警 在真实治疗场景下的潜力，研究人员将靶向PRAME和WT1的binder装配到CAR中，并导入了从健康人血液中分离出的原代T细胞。在体外杀伤实验中，这些CAR-T细胞展现出了强大的、精准的 战斗力 。它们能够高效地杀死装载了相应肿瘤肽段的靶细胞，而对装载了不相关肽段或未装载肽段的细胞则秋毫无犯。经过48小时的孵育，在合适的效应T细胞与靶细胞比例下，对靶细胞的杀伤率(% Lysis)可以达到80%以上，而对照组的杀伤率则在20%以下。这为这些AI设计的binder最终走向临床应用，注入了强心剂。

开启个性化免疫治疗的新篇章

这项发表在《科学》杂志上的研究，远不止是创造了几个新的抗癌 分子 。它真正开创的，是一个全新的、可规模化的、高效理性的药物设计范式。它告诉我们，借助生成式AI的力量，我们可以在短短数周内，完成过去需要数年时间、耗费巨资且成功率极低的靶向pMHC-I药物的开发。

这个平台化的方法，有望从根本上改变免疫治疗领域的游戏规则。 想象一下未来：当一位癌症患者被确诊，医生可以对其肿瘤进行测序，找到其独特的突变新抗原(neoantigen)，同时确定其HLA分型。然后，将这些信息输入AI设计平台，在几天之内，AI就能为这位患者 量身定做 出最适合他的CAR-T疗法所需要的特异性binder。这不再是科幻小说的情节，而是这项技术所指向的、触手可及的未来。

通过将人类对免疫学的深刻理解与AI强大的模式识别和创造能力相结合，我们正在进入一个可以主动设计、而非被动筛选生物大分子的新时代。这些由AI精心绘制的 钥匙 ，将有望打开无数扇过去紧闭的疾病治疗之门，为全球数百万患者带来新的希望。

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