空间转录组学的新突破:设置聚光灯 让RNA自己说话！

这项技术允许研究人员通过光交联选择特定的目标细胞，然后用DNA条形码对目标细胞的所有RNA序列进行地理标记，然后在DNA驱动技术的帮助下翻译成DNA单链进行NGS测序。对于同一样本中的不同细胞群，可以使用不同的DNA标签重复Light-Seq过程，以进行后续分析(图3)。

图3 3轻序列概述(来源：[2])

Light-Seq项目由Jocelyn(Josie)Kishi博士、Sinem萨卡人博士、刘宁宁博士和Emma West博士领导。2019年，基什、萨卡人和韦斯特共同开发了一种名为SABER-FISH的空间转录组学方法，用于直接成像完整组织中的基因表达，可以在固定的细胞和组织中将RNA和DNA FISH信号放大5至450倍。但要捕捉到细胞完整的基因表达程序，还有几个数量级的差距。每个细胞中有成千上万个不同的RNA分子，RNA分子过于密集，目前的成像技术无法完全捕捉到。Kishi说，而Light-Seq在更高分辨率的DNA标签和NGS全转录组测序的帮助下，两全其美地解决了这个问题。

首先，DNA引物与细胞内的RNA分子进行碱基配对，以RNA为模板，扩增RNA的拷贝，即互补DNA (cDNA)。然后在紫外光的照射下，含有超快光交联剂的标记DNA通过光交联反应粘在目标区域的cDNA上，而未被紫外光照射的区域的标记DNA将在后续步骤中被洗脱，从而标记出感兴趣的区域。如果通过使用不同的标记并结合紫外线照射不同的区域来重复该过程，则可以标记更多的区域。

图4通过DNA光刻进行空间寻址标记(来源：[2])

接下来，为了使NGS能够阅读标记的靶cDNA序列，RNA-cDNA杂交体中的RNA被特定的酶水解，并提取标记的cDNA。然后，利用研究人员新开发的基于纳米驱动技术的剪接反应，将标签DNA和目标cDNA序列转录成新的DNA单链。这些新的DNA单链可以用于随后的NGS测序(图5)。

图5轻序列的剪接反应和工作流程(来源：[2])

为了验证这项技术的细胞选择能力和标记能力，研究人员将稳定表达eGFP的小鼠3T3细胞和人类HEK细胞混合进行测试。基于eGFP表达和细胞形态学信息，研究人员人工选择细胞，并用不同的标签进行标记。结果表明，小鼠和人类图谱对各自的标签有很好的区分率，特别是分类到人类标签中的eGFP阅读正确率高达930.5%。提取序列后，对样品进行多重免疫荧光检测，以验证样品的完整性，用于二次分析。

在培养细胞中首次验证了Light-Seq之后，研究人员希望将其应用于更复杂的组织，因为组织样本中特定细胞群的RNA测序仍然具有挑战性，尤其是在靶细胞很少或难以分离的情况下。因此，Kishi、Liu和West联合起来将Light-Seq应用于小鼠视网膜切片。研究人员手动划分了视网膜的三个细胞层，它们具有经典功能，但没有被使用。结果表明，Light-Seq达到了与单细胞测序法相同的序列覆盖率，并发现视网膜三个主要层之间富集了数千个RNA(图6)。此外，样品保持完整，蛋白质和其他生物分子仍然可以进一步成像。