2020年4月CRISPR/Cas最新研究进展

5.

doi:10.1038/s41587-020-0437-z

近日，一项刊登在国际杂志Nature Biotechnology上的研究报告中，来自多伦多大学等机构的科学家们通过研究开发了一种新技术能同时对基因组中多个位点进行编辑，从而就有望帮助研究不同DNA的组合与人类健康和疾病的关联。基于CRISPR的DNA编辑技术能通过对任何人类基因进行精确剔除来研究其功能，从而就能彻底改变科学家们对人类基因组的研究，但目前研究人员仍然面临众多挑战，比如如何在相同细胞中同时移除多个基因或基因片段，这种类型的基因组“手术”对于科学家们而言，了解基因组不同部分在正常生理和疾病状况下是如何协同发挥作用的似乎更为重要。

如今研究人员开发了一种名为CHyMErA（Cas Hybrid for Multiplexed Editing and Screening applications）的新技术，其能应用到任何哺乳动物细胞中，同时系统性地靶向作用多个位点的DNA片段，CRISPR剪刀能通过导向RNA分子将DNA切割酶运送到基因组上的预想位点中，而使用最为广泛的DNA切割酶就是Cas9酶，自Cas9问世以来，科学家们一直寻找其它具有独特特性的Cas酶，以寻求改进和扩展该技术的应用；与CRISPR-Cas9技术不同的是，ChyMErA技术能将Cas9和Cas12a两种不同的DNA切割酶进行结合，从而实现多种用途，Cas12a酶是一种能用来在相同细胞中产生多个导向RNA分子的关键酶类，而这是同时进行DNA编辑的关键。

研究者Thomas Gonatopoulos-Pournatzis表示，我们花费了多年来开发能同时检测Cas9和Cas12a酶的组合性基因编辑技术，随后我们将这些酶类进行结合开发出了ChyMErA系统；研究人员尝试了多种方法来诱导基因片段缺失，但并没有哪一种手段会比ChyMErA更加有效；研究者发现，ChyMErA能够成功剔除基因片段，随后研究者在大规模筛查中利用该技术来系统性地分析基因如何进行结合来发挥作用。在ChyMErA技术的帮助下，研究人员就能够使用两种酶中最好的酶类来进行基因编辑，Cas9已经被广泛改进拥有较高的编辑效率，而Cas12a则能允许多种导向RNAs的使用，因此其在寻找能在基因组中进行位点切割上具有更大的灵活性。

6.

doi:10.1038/s41565-020-0669-6

在最新一期Nature Nanotechnology上，Qiang Cheng等人提出了一种称为选择性器官靶向(SORT)的方法，通过生物工程将含有核酸疗法的LNPs诱导肝脏、脾脏和肺特异性基因调控。LNP系统通常由磷脂、胆固醇、聚乙二醇(PEG)脂质和可电离的阳离子脂质组成。每个LNP成分及其摩尔比都已被优化，以确保高效的核酸递送到肝细胞。特别是，合理设计和筛选可电离的阳离子脂质(或类脂质)文库对于实现临床应用相关剂量的肝基因沉默至关重要。最有效的电离阳离子脂质，其特征是明显的pKa值在6.2和6.5之间，具有三种功能：(1)在LNP生产期间，酸性pH值下质子化的叔胺脂质头部促进其与带负电荷的核酸结合，(2)在生理的pH值，附近无电荷的脂质确保净中性表面电荷，以减少免疫反应和循环时间延长和(3)细胞摄取后进入酸化的内体中，正电荷脂质促进膜融合和有效的胞质递送。

在这种SORT方法中，作者添加五分之一脂质成分来通过静脉注射递送功能信使核糖核酸或基因编辑复合物道特定组织。使用一个快速的混合过程，这种SORT脂质 (永久的阳离子和阴离子或可质子化的阳离子)和不同摩尔比的其他材料生成一个脂质体文库，包载mRNA编码荧光素酶进行体内筛选。通过增加永久性阳离子脂质1，2-二烯烃-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)的摩尔百分比(0-100%)，可使荧光素酶的表达在静脉注射后从肝脏转移到脾脏和肺。LNPs中加入10-40%的永久性阴离子脂质1，2-二烯醇化酶-sn-甘油-3-磷酸(18PA)可在脾脏中特异性表达荧光素酶。加入20%的其他可电离的阳离子脂类，如1，2-二烯酰-3-二甲基氨基甲烷-丙烷(DODAP)，不会改变生物分布，但增加了mRNA对肝脏的递送。该方法的普遍性通过将LNP与其他永久性带电或可电离的阳离子脂类功能化而得到证实，这导致了器官表达的类似变化，且表现出与脂类相关的方式。值得注意的是，SORT-LNP的疗效离不开可电离的阳离子脂质包合。给予肺、脾脏和肝脏特异性mRNA SORT-LNP的筛选结果表明，基于荧光素酶的筛选可产生持续的治疗性蛋白，且无明显毒性。重要的是，SORT方法还允许调节LNPs组织特异性荧光素酶的表达，使其与临床批准的Onpattro配方相同。