Science论文解读!开辟出CiBER

2020年12月16日讯/BIOON/---CRISPR-Cas9可以很轻易地敲除或调剂单个基因，以肯定其对无机体或细胞，甚至另一个基因的影响。然则，假如你能一次停止几千个试验，应用CRISPR逐一对基因组中的每一个基因停止调剂，并疾速看到每一个基因的影响呢，那会怎样样呢？

在一项新的研讨中，来自美国加州年夜学伯克利分校的研讨人员开辟出一种复杂的办法来做到这一点，它让任何人都可以对细胞（包含人类细胞）停止剖析，并敏捷肯定基因组中一切调控特定基因表达的DNA序列。相干研讨成果揭橥在2020年12月11日的Science期刊上，论文题目为“CiBER-seq dissects genetic networks by quantitative CRISPRi profiling of expression s”。

CiBER-seq道理表示图，图片来自Science, 2020, doi:10.1126/science.abb9662。 固然这项技巧将次要受害于对影响感兴味基因的收集停止追踪的人员，它也将协助人们疾速找到掌握疾病基因的调控序列，并能够找到新的药物靶点。

论文通信作者、加州年夜学伯克利分校分子与副传授Nicholas Ingolia说，“你能够想要应用这种办法的疾病是癌症，在癌症中，我们晓得癌细胞为了生活和发展而表达且是须要表达的某些基因。这个对象会让你问成绩：下游基因是什么，哪些是我们晓得的掌握这些基因的调理因子？”

这些调理因子能够更轻易经过药物加以靶向以封闭癌细胞。这种新技巧简化了一些直到如今都很难做到的工作：沿着细胞中的门路回溯，以找到这些最终的调理因子。

他说，“我们有好多向前任务的好办法。这是一种很好的逆向任务的办法，可用于弄清晰一些器械的下游是什么。我以为它在疾病研讨方面有好多潜在的用处。”

他弥补道，“我有时会打个比如，当我们走进一间阴郁的房间，按一下电灯开关，我们就能看到翻开的是什么灯。这个灯就像一个基因，当我们按下开关，我们就能晓得它开启了什么基因。我们曾经在这方面做得很好了。这让我们可以做的是逆向任务。假如我们存眷一个灯，我们想晓得掌握它的开关是什么。这给我们供给了一种办法来做到这一点。”

Ingolia试验室的研讨生Ryan Muller及其同事Lucas Ferguson、Zuriah Meacham与Ingolia在Science期刊上揭橥了他们开辟的这种技巧的细节。

对基因组停止条码化处置

自从8年前CRISPR-Cas9基因编纂技巧呈现以来，想要肯定某个特定基因功效的迷信家们曾经可以用Cas9卵白准确地靶向该基因并将其敲除。在一段与该基因中的DNA互补的导游RNA（gRNA）的引诱下，Cas9卵白联合并切割该基因，或许像CRISPR搅扰（CRISPRi）那样，克制它。

在最复杂的测试中，细胞或无机体要么生活，要么逝世亡。但是，可以寻觅基因敲除的更奥妙的影响，例如特定基因能否开启或封闭，或许它被调高或调低了若干。

现在，这须要添加一个申报基因--平日是一个编码绿色荧光卵白的基因，所添加的申报基因衔接到启动你感兴味的基因表达的启动子的雷同拷贝上。因为每个基因共同的启动子决议了该基因的表达工夫，假如Cas9基因敲除影响了你感兴味的基因的表达，也会影响申报基因的表达，使细胞培育物在荧光灯下发绿光。

虽然如斯，的全体基因有6000个--而人类的全体基因有2万个---要调剂每个基因并发明对荧光申报基因的影响是一项年夜工程。

他说，“CRISPR使得片面查询拜访基因组中的一切基因并对它们停止扰动变得很轻易，但随后最年夜的成绩是，你若何读出每个扰动的后果？”

这种新技巧，Ingolia称之为CiBER-seq（CRISPR interference with barcoded expression reporter sequencing），处理了这个成绩，经过让数万个CRISPR试验归并在一路，同时完成这些试验。该技巧摒弃了荧光，采取深度测序的方法，直接测量归并样本（pooled sample）中基因活性的添加或削减。深度测序采取高通量、长读的新一代测序技巧，对归并样本中表达的一切基因停止测序和根本计数。

Ingolia说，“在归并的CiBER-seq试验中，在一天之内，我们可以找到几个分歧靶基因的一切下游调控因子，而假如你要应用基于荧光的技巧，每一个靶基因都须要你破费多天的测量工夫。”

对生物体内的每个基因停止平行CRISPR剖析是很直接的，这要归功于那些出售现成的、与Cas9卵白一路应用的单导游RNA（sgRNA）的公司。迷信家们可认为基因组中的每个基因订购sgRNA，为每个基因可以订购十几种分歧的sgRNA---年夜多半基因都是由数千个核苷酸构成的，而sgRNA的长度年夜约为20个核苷酸。

Ingolia团队的症结立异是将每个sgRNA与一个共同的、随机的核苷酸序列---实质上是一个条形码---衔接到启动子上，只要当感兴味的基因也被开启时，该启动子才会转录条形码序列。每个条形码可申报一个sgRNA的后果；在不计其数个sgRNA的庞杂文库中，一个sgRNA靶向感化于一个基因。深度测序可以告知你样品中每个条形码（对酵母而言，年夜约有6万个条形码）的绝对品貌，让你疾速评价中6000个基因中的哪一个对启动子有影响，从而对感兴味的基因的表达有影响。关于人类细胞来说，能够会拔出20多万个分歧的gRNA，屡次靶向感化于每个基因。