血红卵白微生物发酵法合成研讨取得停顿

近日，Trends in Biotechnology在线颁发了江南年夜学将来食物迷信中间和生物工程学院陈坚院士团队的综述Recent advances in the microbial synthesisof hemoglobin。赵鑫锐副研讨员为第一作者，周景文传授为通信作者，论文作者还包含陈坚传授和堵国成传授。

血红卵白是一类存在于原核和真核细胞中的以血红素为辅基的含铁金属卵白，在生物体内具备运输和贮存氧、调理胞内pH值、调控心理代谢等诸多紧张功效。近年来，血红卵白曾经被利用于急诊医学（作为无细胞氧）、医疗保健（作为铁补给剂）、食物加工（食物级着色和调味剂）等畛域。但血红卵白的获取依然必要依靠从血液或动物组织中提取，提取法不仅费时低效、而且所用化学试剂还易形成情况净化。是以，以微生物细胞工场为平台来合成分歧起源的血红卵白曾经成为近年来的研讨热门。

在NCBI的GeneBank数据库中已有超过141110条的血红卵白基因编码序列，在EMBL卵白数据库中已有超过84424条的血红卵白氨基酸序列，在PDB卵白晶体数据库中也曾经有725条血红卵白的三维构造数据，但现阶段此中只有15种分歧起源（人、年夜豆、鳄鱼等）的血红卵白可由9种无限的微生物（年夜肠杆菌、酿酒、枯草芽孢杆菌等）合成。依据对现有血红卵白氨基酸序列进行体系发育树阐发，发现分歧起源的血红卵白及其亚基分为几类：植物起源血红卵白α亚基、β亚基以及其他类型亚基，动物起源单亚基血红卵白、微生物起源血红卵白（图1）。是以，可以综合利用今朝越来越成熟的代谢工程和合成生物学战略，开辟出无效且稳定的血红卵白微生物合成办法，来知足对人、年夜豆、通明颤菌等分歧物种血红卵白的年夜规模利用的需求。

血红素是血红卵白执行其心理功效所必需的辅基，要想高效合成血红卵白起首必要进步胞内血红素的供应程度。在自然界中血红素的合成次要通过C4和C5两种路径（图2），通过强化C4路径并补加甘氨酸和琥珀酸作为底物或强化抗反应克制的C5路径都可以添加胞内血红素前体5-氨基酮戊酸（ALA）的含量。在此根底上持续强化并模块化改革血红素合成的上游路径，可在年夜肠杆菌中不增加底物的环境下完成115.5±2.3mg/L血红素的合成。此外，因为胞内过高含量的血红素会显着克制菌体的成长，应用血红素转运卵白可以完成超过60%血红素的排泄合成，以加重血红素对细胞的毒性作用。

在进步血红素供应程度的根底上，应用年夜肠杆菌、等微生物宿主合成分歧起源血红卵白已得到胜利。因为代谢改革成熟和培育本钱昂贵，今朝超过70％的血红卵白均由年夜肠杆菌合成。起首为了加强年夜肠杆菌中血红卵白的可溶性，暗码子优化、启动子和的适配组合、以及卵白匆匆溶标签均已被胜利利用来防止原谅体的造成；其次为了加强植物起源血红卵白α亚基的表白量，α亚基编码基因的串联表白和稳定辅因子AHSP的共表白也已被用于进步α亚基的稳定型；此外因为年夜肠杆菌宿主中血红素的合成和运输才能较弱，可以通过引入志贺假单胞菌的血红素转运体系并在胞外增加高浓度的血红素，以添加细胞内血红素程度（图3）。在初步得到血红卵白的根底上，还可以进一步通过：将人源血红卵白α亚基和牛源血红卵白β亚基相联合，开辟出一种自聚合的人牛杂源血红卵白（180-500kDa聚合物）来缩短贸易化无细胞氧产物在血液中的半衰期；在宿主中共表白甲硫氨酸氨基肽酶以减速血红卵白N末尾蛋氨酸残基的正确实除；优化诱导剂浓度、诱导温度等发酵前提来进步血红卵白的产量。

除年夜肠杆菌之外，酿酒酵母、毕赤酵母等酵母菌株也是合成血红卵白的高效平台。但在后期研讨中，酿酒酵母合成血红卵白的产量较低，近几年通过优化血红卵白α和β亚基之间表白程度的比率、强化血红素合成路径、敲除转录因子Hap1p改革氧气传感路径（图3），人源血红卵白的最高含量可以到达细胞中总可溶性卵白的7％。毕赤酵母是今朝临盆贸易化年夜豆血红卵白的高效宿主，所得年夜豆血红卵白可增加到新型天然肉产物中来模拟真肉的肉色和风味。Impossible Foods公司开辟的可以贸易化合成年夜豆血红卵白的毕赤菌株，曾经得到了的允许并在多个国度申请了专利。在该菌株中血红素合成所需的八种酶被分为三个模块，并别离用甲醇诱导的AOX1启动子进行了强化表白；此外两个拷贝的年夜豆血红卵白的基因和转录激活因子Mxr1p也被整合到基因组中；末了，通过优化高密度发酵前提，完成了年夜豆血红卵白的年夜规模工业临盆（图3）。

今朝应用微生物来合成血红卵白尽管曾经得到了胜利，但年夜部门血红卵白的产量还较低，这对在临盆中利用重组血红卵白提出了严重挑战。在将来的研讨中可以采取新的战略来进行强化菌株的合成才能（图4）：起首可以通过深度培训的办法发现编码未知的具备特别功效或个性的血红卵白基因，例如具备低温不易变色个性的三叶草血红卵白等；其次应持续寻觅血红素合成路径中的限速步调，并利用卵白质支架等战略解除这些步调之间的空距离离；再次应克制胞内血红素合成路径中的副产品和血红素加氧酶对血红素的降解；末了因为血红素对细胞有毒性作用，而且血红素合成路径中酶的适度表白会添加宿主的代谢负担，是以利用血红素感应器来完成血红素合成和血红卵白表白之间的代谢均衡是突破血红卵白合成瓶颈的症结。(100yiyao.com）