Cell子刊：应用高度多重的ddPCR办法更好地检测患者体内的HIV病毒库

2021年4月23日讯/BIOON/---定量确定具备复制才能的HIV病毒库关于评价医治战略至关紧张。病毒成长实验（viral outgrowth assay, VOA）低估了HIV病毒库，由于它未能诱导一切具备复制才能的HIV前病毒（provirus，即病毒基因组整合进宿主细胞DNA的HIV）。针对HIV单个区域或两个区域的HIV DNA测试（别离称为单重测试和双重测试）高估了HIV病毒库，由于这些测试办法未能扫除许多出缺陷的HIV前病毒。

基于PCR的测试办法是高度敏锐的，相比于VOA而言必要更少的血液。然则，在PCR测试办法中，人们通常针对单个激进性的靶点进行检测，这会极年夜地过高估量具备复制才能的HIV 病毒库的年夜小，这是由于年夜多半整合到宿主细胞DNA中的HIV前病毒都是缺点性的，并且针对单靶点的PCR测试并不区分完全的HIV前病毒和具备DNA缺失和/或功效失活渐变的HIV前病毒。靠得住地估量上完全的HIV前病毒必要验证HIV基因组上的多个区域的存在，以及所检测每个区域上的靶序列是否来自雷同的HIV前病毒。

微滴式数字PCR（ddPCR）提供了一种替代性选择。在ddPCR中，PCR反馈液（包含模板DNA）被联系成数千个独自的液滴，每个液滴的PCR检测成果别离申报。2019年报道的一种ddPCR测定方案应用了此类多重办法，在每个液滴内探测HIV-1基因组的两个区域。

在一项新的研讨中，美国研讨职员使用两种针对HIV基因组的3个区域（三重）的ddPCR测定办法（下称测定办法1和测定办法2）来开辟一种5区域测试办法（这两种三重ddPCR测定各自针对两个共同的HIV基因组区域，但独特针对1个堆叠区域，从而许可批间质量节制）。通过联合这两种平行的三重ddPCR测定办法，这些作者有信念对真正完全的HIV-1病毒基因组进行定量确定。作为进一步的改良，他们优化了此中的一种特同性定量确定T细胞的多重ddPCR测定办法，以便精确地将定量确定的数目与待研讨的HIV靶细胞的数目进行正常化。这个额定的步调关于组织活检特殊有用，由于与血液相比，组织中的细胞群体难以拆散和纯化。相关研讨成果颁发在2021年4月20日的Cell Reports Medicine期刊上，论文题目为“A highly multiplexed droplet digital PCR assay to measure the intact HIV-1 proviral reservoir”。

详细而言，测定办法1的三个HIV靶点位于HIV pol基因的3公众端、tat基因和env基因，而测定办法2的三个HIV靶点位于长末尾反复序列（LTR）/gag区域、pol基因的5公众端和env。每种测定办法中，针对每个HIV靶点设计特同性的引物和探针。在每种测定办法的三个HIV靶点中，有两个使用雷同的染料进行探针检测，但浓度分歧，以便可能在荧光振幅的X/Y图上区分分歧的HIV靶点。这使得这些作者可能对含有分歧靶点组合的液滴进行定量确定。针对env的引物和探针在测定办法1和测定办法2中是雷同的，在201个临床样本中，这两种测定办法的env性能简直雷同。此外，在这些临床样本中，五对引物/探针检测靶点的失败率极低：gag 0.5%；3公众 pol 1%；env 3.1%（两种测定办法均如斯）；tat 3.6%；5"大众 pol 6.3%。

两种HIV-1三重ddPCR测定办法的设计，图片来自Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100243。

这些作者应用这种5区域测试办法评价了含有这5个区域的HIV前病毒的数目。他们评价的HIV前病毒数目均匀比配对的定量VOA办法高12.1倍而且与后者相关（Spearman公众s ρ = 0.48），然则他们以此估量的HIV病毒库要比之前的DNA测定办法显著削减。

这些作者将他们的测试办法使用于来自承受抗逆转录病毒药物（ART）医治的HIV感化者的纵向血液样本和粘膜样本。在这些患者中，完全的HIV前病毒在血液CD4+T细胞中的衰加速度快于出缺陷的HIV前病毒，并且完全的HIV前病毒在粘膜T细胞和轮回T细胞中的频率类似。（100医药网 100yiyao.com）

参考材料：

Claire N. Levy et al. . Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100243.