细胞探秘之旅——多维度解析细胞性命运动

拆散的人类胰岛的三维重修:绿色的胰岛素(AF488)，赤色的胰高血糖素(AF555)，洋赤色的IL-17 (AF647)和蓝色的细胞核（Hoechst）Courtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)

细胞是性命的根本单元，细胞生物学是研讨细胞构造和功效的学科。细胞生物学研讨热门次要聚焦在细胞外部构造、细胞旌旗灯号通路、细胞器功效和构造解析、能量代谢和表观遗传等方面，细胞生物学研讨难点在于细胞长短常精细且巨大的单元，而察看设备存在空间、光阴以及分辩率上的限定。

跟着显微镜和染色技术的改良，迷信家们可能看到越来越多的细胞外部细节。范·列文虎克使用的显微镜能够把标本缩小了几百倍。本日，高分辩率荧鲜明微镜可以在微米及以下范畴察看细胞器的形态，借助活细胞任务站可以将细胞的性命运动完全记载上去；通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对细胞进行三维光学切片成像，使研讨职员可能天生细胞的具体三维图像；应用STED纳米显微镜可以探求细胞器外部构造、离子通道的亚基乃至分子程度的精密构造信息……想要充沛扩大本人的研讨结果并得到高质量的数据，选择适宜的显微成像办法至关紧张。

细胞生物学研讨痛点

细胞精密构造解析解决

--STED纳米显微成像技术

STED是基于STELLARIS共聚焦平台纯光学超高分辩技术，联合疾速荧光寿命采集体系完成XY轴30nm分辩率极限。同时运用FLIM Phasor技术可显著下降STED激光能量，实用于活细胞超高成像。TauSTED特殊得当利用于组织和细胞内巨大构造和物资的察看，如膜卵白与膜微构造域、细胞器外部的巨大构造察看、细胞骨架构造、神经元突触研讨、细菌外部的物资构造研讨、病毒学研讨、卵白复合物研讨等等。

借助STED技术提醒核孔复合物构造

STED提醒分歧状态下线粒体膜交融进程

--DMi8 Infinity TIRF

TIRF（全内反射荧鲜明微镜）次要利用偏向：细胞膜成像、囊泡运输、单分子示踪、受体能源学变动/凑集、受体超分辩成像、体外卵白研讨、细胞骨架组装、胞吞胞吐、细胞粘附、细胞活动。

Hela细胞，使用Dil标志细胞膜（左图一般荧鲜明微镜，右图TIRF膜成像）

--STELLARIS FALCON疾速荧光寿命成像体系

STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案，将FLIM完满联合到STELLARIS共聚焦平台，完成疾速FLIM数据采集。

今朝，FLIM技术越来越多的利用到生物学研讨中，罕见的利用有测定分子互相作用FLIM-FRET，情况感知和组分拆散等，在活细胞中典型利用便是应用FLIM-FRET研讨活细胞分子互相作用。

扫除荧光漂白和淬灭对FRET测定的影响，精准丈量分子间互相作用强度。无需思索acceptor荧光，试验复杂。可进行离体活细胞和在体活细胞疾速FLIM-FRET丈量。

FLIM研讨活细胞代谢

Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose

活细胞解决疾速成像

细胞是构成性命个别的根本单元，及时在线研讨细胞的增殖、代谢、凋亡和应激反馈，有助于相识细胞的性命纪律，通过征象提醒性命实质。

THUNDER高分辩活细胞解决方案

C2C12细胞成长和迁徙到单方transwell膜沾核纤层卵白B(赤色)核构造,赫斯特(蓝色)的DNA,和γH2AX DNA毁伤(黄色)。细胞成像使用THUNDER活细胞培育成像体系与63X/1.4油浸物镜。图片下面代表扩大景深预测厚17.47 m z-stacks。

图片由美国加州年夜学戴维斯分校生物迷信学院神经生物学、心理学和行动系卢卡斯·史女士博士提供。

STELLARIS Lightning

细胞生物学研讨曾经不再局限于细胞层面察看，而是聚焦于亚细胞器、染色体、离子通道等粗大构造，传统宽场荧鲜明微镜尽管有成像速率快、光毒性低的有点，然则空间分辩率并不克不及知足对亚细胞器更精密构造解析的分辩率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辩体系基于共聚焦平台，XY分辩率到达120nm，Z偏向到达了200nm，超出了一般共聚焦光学极限。

GattaCell，细胞核-DAPI，线粒体-Tom20 Alexa488，Actin-Alexa555，Tubulin-Alexa635Lightning超分辩成像

STELLARIS的每个检测器都是光谱式检测器，可以完成410nm-850nm光谱检测，装备独家的485-685nm或440-790nm白激光，谱线随意率性可调，知足染料最佳激起谱线需求。白激光和HyD检测器完成激起和发射光谱检测自在。STELLARIS共聚焦平台使用棱镜分光和狭缝检测，在随意率性波长都可以有十分高的分光效率，做到最年夜水平应用荧光旌旗灯号。

STELLARIS多色成像

NE-115 cells. LifeAct-mNeonGreen (left: yellow, right: red), MitoTracker Green (left: yellow, right: green), NUC Red (left: gray, right: blue), and SiR-tubulin (left: gray, right: magenta) .Courtesy: Max Heydasch, University of Bern and Spirochrome

TauSense光阴分辩共聚焦成像体系

NE-115细胞同时标志了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、细胞核Red和SiR-tubulin共4种荧光染料，但因为LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的发射光谱高度堆叠，NuC Red和SiR-tubulin的发射光谱高度堆叠，以是在用惯例共聚焦（左图）拍摄时只能体现出两种旌旗灯号的差别。而在TauSeparation形式下（右图），基于均匀光子达到光阴AAT，咱们使用一个检测器就可以同时将这两种发射光谱堆叠的染料区分进去（LifeAct-mNeonGreen-赤色，Mitotracker Green-绿色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品赤色），以是只要要使用两个检测器，就可以获得这幅没有串色的4色荧光图像了。

活体植物、类器官程度

STELLARIS DIVE光谱式多光子显微成像体系

4Tune – the world’s first and only spectral NDD

Blue: Astrocytes, Sulforhodamine;Green: Microglia, GFP;Yellow: Neurons, YFP;Red: Blood, Alexa680-Dextran

活体小鼠在体脑细胞多色成像

多光子FLIM在活体细胞程度研讨药物靶向作用机理

用FLIM-FRET研讨药物对胰腺导管腺癌(PDAC)的靶向作用，完成了对肿瘤分歧微区的单细胞反馈的察看。

Conway JRW, et al. Cell Rep. 2018 Jun 12;23(11):3312-3326.

Intravital Imaging to Monitor Therapeutic Response in Moving Hypoxic Regions Resistant to PI3K Pathway Targeting in Pancreatic Cancer

STELLARIS DLS光片成像

Leica STELLARIS共聚焦平台可以无缝降级light sheet功效，降级后一套仪器同时领有完全的共聚焦和光片的功效。Leica DLS数字光片技术可疾速完成双侧照明，具备光毒性低，成像速率快，得当3D成像的优点。DLS和双光子共聚焦搭配，可以完成定点毁伤和疾速光片成像相联合。

Movie courtesy of B. Eismann/C. Conrad at BioQuant/DKFZ Heidelberg

3D培育细胞光片成像

细胞操作

--Leica DMi8 Infinity Scanner

Hela Cells expression paGFP-H2B (histone marker). Courtesy Rebecca Smith, LMU, Munich.

Leica Infinity Scanner完成疾速：

--激光切割、溶解、解笼锁、DNA毁伤

--光激活、光开关、漂白、光遗传

--FRET受体漂白法等光学刺激试验

--Leica DMi8 Infinity PLU脉冲激光模块

Infinity PLU利用：

--活细胞切割

--活细胞和细胞器溶解

--DNA毁伤

MDCK cells, cutting;Sample Courtesy: Prof. Dr. Ralf Jacob, Marburg, Germany

激鲜明微切割精准取材

Leica激鲜明微切割劣势

1.正置镜平台，得当病理切片和活细胞样本切割；

2.明场和荧光及时切割，操作复杂疾速；

3.紫外激光切割，间接汽化，切缘平整不毁伤生物年夜分子；

4.专利的激光束挪动切割，切割精度可达0.07μm；

5.重力搜集，复杂高效，搜集耗材本钱低，适用高通量切割对象

单细胞克隆制备

THUNDER Imager EM Cryo CLEM冷冻光电联用助力细胞超精密构造解析

传统光电联用受限于光镜分辩率，荧光数据在电镜下目的不明白，THUNDER Cryo-CLEM是冷冻光电联用公用设备，具备分辩率高可以精准辨认细胞构造，在相关任务流程中安稳、平安传送坐标、图像和样本。

冷冻光电联用试验流程Cryo-CLEM / Cryo-ET

徕卡冷冻光电联用劣势：

--冷冻光镜公用传输杆，改换样品不便

--传输杆液氮控温，确保样品平安转移

--有一般载网夹具和Auto grid夹具

--该流程中一切附件均由徕卡提供，防止第三方纷争