《细胞》:解开最毒乳腺癌易复发之谜

来源：奇点蛋糕2022-05-10 11:09

三阴性乳腺癌(TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌类型。因为它不表达激素受体和HER2，所以不能使用靶向治疗。长期以来，TNBC患者只能接受手术和放化疗。

三阴性(TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌类型。因为它不表达激素受体和HER2，所以不能使用靶向治疗。长期以来，TNBC患者只能接受手术和放化疗。

穴位抑制剂疗法的出现给TNBC患者带来了新的希望，但临床试验发现PD-1抑制剂联合化疗只能使少部分TNBC患者受益[1，2]。因此，探讨TNBC对免疫检查点抑制剂的耐药机制非常重要，这将为提高免疫治疗的效果提供参考。

近日，达纳-法伯癌症中心朱迪思阿古多教授领导的研究小组在《细胞杂志》上发表了重要研究成果[3]。他们发现，在TNBC有一组静息肿瘤细胞(qcc)抵抗T细胞杀伤。通过激活HIF1a，这些qcc与免疫抑制成纤维细胞和功能障碍的DC细胞一起，形成了一个抵抗T细胞浸润和杀伤的微环境。从而在免疫治疗中幸存并导致肿瘤复发。

这项研究揭示了乳腺癌免疫逃逸的奥秘，突出了QCCs在乳腺癌免疫逃逸中的重要作用，并提示靶向消除QCCs可能是解决TNBC免疫耐药问题的有效途径。

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以往的研究发现，一些基因在肿瘤细胞对免疫治疗的抵抗中起一定作用[4，5]，但这些研究无法解释肿瘤细胞如何创造免疫抑制微环境；此外，免疫检查点抑制剂治疗耐药肿瘤的一些特征可以通过测序发现，但肿瘤组织中存在大量的异质性细胞群，这大大增加了寻找耐药机制的难度。比如丢失了肿瘤抗原的癌细胞和肿瘤抗原阳性的癌细胞，在逃离免疫系统的过程中，显然采取了不同的方法。

在这项研究中，阿古多教授的团队希望探索表达肿瘤抗原的癌细胞如何逃脱免疫系统的追捕。因此，他们用表达GFP或mCherry的TNBC细胞系4T07接种小鼠，并输注特异性识别GFP的PD-1-/-Jedi T细胞(PD-1被敲除以模拟PD-1抑制剂治疗)。绝地T细胞的TCR只能特异性识别GFP，不能识别mCherry。因此，该实验模型可用于探索持续表达肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞(GFP肿瘤细胞)如何逃脱肿瘤抗原特异性T细胞(Jedi T细胞)的攻击。

研究小组分析了转移Jedi T细胞后第5天肿瘤中GFP与mCherry肿瘤细胞的比例，发现Jedi T细胞杀死了大部分GFP肿瘤细胞，但仍有部分GFP肿瘤细胞逃脱了T细胞的杀伤。免疫染色显示，这些逃避杀伤的GFP肿瘤细胞形成了细胞簇，细胞簇中T细胞的浸润水平下降了两倍。这表明存活的GFP肿瘤细胞簇可以阻止T细胞的浸润，这可能是其对免疫治疗产生抵抗的原因之一。

JET细胞攻击后存活的GFP肿瘤细胞聚集。

接下来，阿古多教授的团队分析了存活的GFP肿瘤细胞和对照肿瘤细胞之间的转录组差异。他们发现，与mCherry肿瘤细胞相比，GFP肿瘤细胞中与细胞周期相关的基因明显下调。EdU(胸苷类似物5-乙炔-20-脱氧尿苷)掺入实验表明，这些存活于绝地T细胞的GFP肿瘤细胞处于细胞周期停滞状态(称为静止肿瘤细胞，QCCs)。

那么这些qcc是不是更能抵抗T细胞的杀伤呢？研究小组将tdTomato-p27K转入肿瘤细胞，可以使qcc被tdTomato标记。将PD-1-/- Jedi T细胞转入荷瘤小鼠后，发现与对照无免疫原性的miRFP670肿瘤细胞相比，存活的GFP肿瘤细胞大部分属于tdTomato，这表明QCCs对T细胞的杀伤具有更强的抵抗力。

在绝地T细胞攻击下存活下来的GFP肿瘤细胞处于细胞周期的静止状态，对T细胞的杀伤有更强的抵抗力。

以上结果表明，QCCs是小鼠模型免疫治疗的主要耐药。这种现象在人类患者身上也存在吗？通过分析乳腺癌患者的组织病理学样本和转录组测序，研究团队发现肿瘤组织中与T细胞接触的肿瘤细胞大多是Ki67的增殖细胞，p27的QCCs很少与T细胞接触。同时，基因集合富集分析显示，与无应答者相比，免疫治疗应答者的肿瘤细胞在DNA复制相关通路上更为丰富，表明其处于非稳态。这种相关性提示QCCs可能与乳腺癌患者免疫治疗效果差有关。

乳腺癌组织中静止期肿瘤细胞周围T细胞浸润较少，对免疫治疗有反应的患者肿瘤细胞处于活跃的细胞周期。

为了探索QCS的耐药机制，研究小组对QCS和非稳态肿瘤细胞的RNA进行了测序。数据分析显示QCCs上调缺氧和糖代谢相关基因。免疫染色结果显示p27K QCCs与缺氧探针共定位，而T细胞很少渗入缺氧区。在JET细胞治疗中存活的GFP肿瘤细胞也位于低氧区域。这些数据表明，乳腺癌中的QCCs主要位于低氧微环境中，T细胞浸润较少。

QCCs所在区域明显处于低氧状态，T细胞浸润较少。

接下来，为了在单细胞水平上分析QCS抑制T细胞功能的机制，阿古多教授的团队分离了QCS细胞簇内外的浸润细胞，并对其单细胞转录组进行了测序。

通过数据分析发现，QCS细胞团中存在大量免疫抑制性成纤维细胞，这解释了为什么QCS地区浸润性T细胞数量较少。

对QCS细胞团内外浸润的T细胞的分析表明，缺氧的QCS细胞团内浸润的CD8 T细胞耗竭更深，杀伤能力更弱。

QCS细胞团内有大量免疫抑制性成纤维细胞，浸润的T细胞数量明显低于QCS细胞团外，QCS细胞团内浸润的T细胞耗竭程度更高。

哪一组细胞促进了T细胞的功能失调？通过对QCS浸润的各个细胞亚群的缺氧特征进行评分，研究小组发现DC细胞表达了丰富的缺氧相关基因，下调了促进T细胞活化的基因，如MHC 和MHC 、IL-12、CD80/86，表明这些DC细胞促进T细胞活化的能力大大减弱，这可能是QCS细胞簇浸润的T细胞功能障碍的重要原因。

然而，阿古多教授的团队通过缺氧诱导实验发现，缺氧并不能直接削弱DC细胞激活T细胞的能力，因此研究团队将注意力转向了QCCs本身。探讨表达HIF1a的qcc是否形成免疫抑制微环境，破坏DC细胞激活T细胞的能力，进而抑制T细胞的免疫反应。因此，他们构建了表达活化HIF1a(HIF1aSTBL)的乳腺癌细胞系。

荷瘤实验表明，与WT肿瘤相比，表达HIF1aSTBL的肿瘤中浸润的T细胞数量更少，耗竭程度更深。MHC在肿瘤DC细胞中的表达明显下调，这与在QCCs细胞群中观察到的结果基本一致。

此外，研究小组将表达HIF1aSTBL的WT或GFP肿瘤细胞与mCherry肿瘤细胞混合，并接种于小鼠皮下。发现与mCherry : GFP肿瘤组相比，接种mCherry : GFP HIF1aSTBL肿瘤细胞的小鼠肿瘤内浸润的T细胞数量较少，T细胞更难接近GFP肿瘤细胞，存活的GFP肿瘤细胞数量增加数倍。可见HIF1a可以促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

HIF1aSTBL在肿瘤细胞中过表达可以抑制T细胞的浸润，逃避T细胞的攻击。

根据以上数据，QCCs正是通过HIF1a的高表达来创造免疫抑制的微环境，逃避肿瘤抗原特异性CD8 T细胞的追逐。那么，敲除肿瘤细胞中的HIF1a是否可以促进T细胞对肿瘤的杀伤？结果显示，HIF1a敲除肿瘤细胞后，肿瘤内浸润T细胞数量明显增加，耗竭程度降低，肿瘤体积明显缩小。这提示在肿瘤中靶向HIF1a可以促进抗反应，抑制肿瘤生长。

敲除肿瘤细胞中的HIF1a可显著增强抗肿瘤免疫反应。

总的来说，本研究揭示了肿瘤抗原阳性癌细胞的免疫逃逸机制：它们聚集在一起，调用成纤维细胞为其构筑屏障；进入静息状态再加上HIF1a的高表达，使得免疫系统的哨兵DC细胞功能失调，进而抑制T细胞的免疫反应。这些努力使他们逃脱了T细胞的追逐，在免疫治疗后东山再起。

同时，本研究结果也提示根除QCCs是提高TNBC免疫治疗效果和肿瘤复发的关键。

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