子问题《自然》:刷新认知！EGFR变异甚至可以抗癌

胶质母细胞瘤(GBM)是一种非常具有侵袭性的癌症。

胶质母细胞瘤(GBM)是一种非常具有侵袭性的癌症。

先前的研究表明，表皮生长因子受体(EGFR)扩增是GBM中一个重要的致癌驱动因素[1-2]。然而，许多针对EGFR的临床试验未能取得良好的效果，这表明EGFR扩增可能在GBM中具有不同的功能[3-4]。

据报道，约57.4%的原发性GBM伴有野生型EGFR(EGFRwt)基因的扩增，这与共扩增的GBM特异性突变EGFR VIII(外显子2-7缺失)[5-6]。研究表明，EGFRvIII可以协同触发配体诱导或组成型激活的EGFR信号转导(在没有EGFR配体的情况下，GBM中EGFR表达引起的自发二聚化引起的信号转导[7])。

还发现组成型和配体诱导的EGFR激活触发不同的信号通路[8-9]。目前，EGFR配体在GBM发生中的生物学功能及其在GBM治疗中的临床意义尚不清楚。因此，组成型和配体诱导的EGFR激活在GBM中的作用和功能值得探讨。

近日，美国德克萨斯大学西南医学中心的Amyn A. Habib教授团队在《自然 细胞生物学》期刊上发表了该研究成果[10]。

他们发现EGFR的组成型激活通过激活TAB1-TAK1-NF- B-EMP1途径促进GBM细胞的侵袭。然而，配体诱导的EGFR激活可通过上调桥整合子3(BIN3)抑制Dock 7-Rhodotpase信号通路，导致GBM细胞增殖和侵袭能力下降。

简单来说，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR，抑制肿瘤细胞的侵袭，将EGFR的作用从癌基因变为抑癌基因！郭博士是论文的第一作者。

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让我们来看看这个研究是如何进行的。

为了探讨配体诱导和组成型激活的EGFR及其介导的信号通路在GBM中的生物学作用。表皮生长因子(EGF)对GBM细胞侵袭的作用在异种移植细胞系(PDX)和来自妙友国际医学有限公司的GBM神经球的原代培养细胞中进行了检测。

结果显示，加入EGF(EGFR配体)抑制了几种表达EGFRwt或EGFRvIII EGFRwt的GBM细胞系的侵袭。用siRNA敲除EGFR后，EGF对侵袭的抑制作用被抵消，表明GBM的侵袭是由EGFR特异性介导的。

研究人员还发现，将低EGFR表达水平的GBM细胞暴露于EGF可以促进侵袭。然而，当EGFR在这些细胞系中过量表达时，加入EGF将抑制侵袭。

同时，用不同剂量的siRNA敲除EGFR，随着EGFR表达水平的降低，EGF逐渐从抑制向促进侵袭过渡，这表明EGFR表达水平决定了配体诱导的EGFR信号传导导致促进还是抑制侵袭。

同时，研究人员将GBM细胞注射到小鼠的大脑中，通过体内显微实验证实，EGF抑制了GBM细胞的侵袭，EGF诱导了许多高或低水平表达EGFR的细胞系的细胞增殖。

然而，当siRNA敲除Src胶原同源衔接蛋白(Shc)时，EGF诱导的增殖受到抑制。Shc敲除抑制了响应EGF的丝裂原活化蛋白激酶1(ERK)的激活，表明配体诱导的EGFR激活通过经典的Shc-ERK途径诱导增殖。

接下来，研究人员进一步探索了EGFR抑制GBM细胞侵袭的下游信号机制。

RNA微阵列分析、WB和qPCR结果显示，加入EGF后，BIN3是上调最高的基因。重要的是，siRNA敲低BIN3阻断EGF抑制GBM细胞侵袭的能力，而BIN3的过表达抑制细胞侵袭。

接下来，研究人员通过质谱鉴定了与BIN3相互作用的蛋白质，发现了胞质分裂7(DOCK7)分子。

共沉淀实验表明，EGF诱导DOCK7与BIN3相互作用，siRNA敲除DOCK7，导致细胞侵袭力和RhoGTPase活性下降。

在DOCK7敲除的细胞中，EGF没有进一步抑制侵袭或降低RhoGTPase的活性，表明DOCK7位于BIN3的下游。同时，siRNA敲除BIN3，抵消了EGF引起的RhoGTPase活性下调。

研究人员还发现，EGF诱导GBM细胞中DOCK7-Y1118的酪氨酸磷酸化。DOCK7-Y1118F的突变导致突变体不能与BIN3结合。结果表明，DOCK7的酪氨酸磷酸化和BIN3的EGFR上调对于DOCK7-BIN3相互作用同样重要。

随后，将TGF (EGFR配体)注射到无胸腺小鼠的脑中以稳定表达。

的GBM12细胞或GBM9神经球细胞，结果表明，TGF 增加提高了小鼠存活率以及抑制了肿瘤侵袭能力。同时，在表达TGF 的肿瘤中，细胞增殖能力增强，但肿瘤体积明显减小。外源性输注EGF也会导致同样的结果。

以上结果表明，配体诱导的EGFR激活通过上调BIN3，进而抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路，导致GBM细胞增殖，侵袭能力下降。

紧接着，研究者探索了构成型EGFR信号通路在GBM细胞中的作用及背后机制。

研究者发现，上皮膜蛋白1（EMP1）是一个通过构成型EGFR信号上调的基因，siRNA敲降EMP1抑制了GBM中EGFR表达引起的细胞侵袭。

质谱分析表明，TAB1与TAK1可能参与了EGFR的构成型信号传导。并且，TAB1能够激活NF- B[11]。siRNA敲降TAB1导致构成型EGFR介导的侵袭、TAK1的激活和NF- B亚基p65磷酸化的丢失。siRNA敲降TAB1或TAK1也阻断了EGFR诱导的EMP1的上调，表明TAB1-TAK1-NF- B-EMP1信号轴驱动了构成型EGFR诱导的细胞侵袭。

此外，研究者发现，在构成型激活的EGFR中观察到低水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有利于激活NF- B-EMP1途径，促进细胞侵袭。而在配体诱导的EGFR中检测到高水平的EGFR酪氨酸磷酸化，这有助于激活EGR1-BIN3信号通路，抑制侵袭。

接下来，研究者发现Jak1和Jak3抑制剂Tofacitinib，在多个GBM细胞系中高度上调BIN3的水平，以及抑制细胞侵袭。Tofacitinib也能上调肝素结合的EGF水平（HB-EGF：EGFR配体），并诱导EGFR的高度激活。

同时，Tofacitinib阻断了STAT1和STAT3的磷酸化，而STAT3敲降模拟了Tofacitinib的作用，引起HB-EGF分泌增加、EGFR活化以及侵袭抑制。此外，西妥昔单抗能够完全抑制Tofacitinib诱导的EGFR活化、BIN3上调和侵袭抑制。

研究者又探索了Tofacitinib对于小鼠颅内GBM肿瘤的影响，肿瘤细胞为GBM12TGF 的小鼠（高水平的EGFR配体），从Tofacitinib治疗中没有额外受益。然而，肿瘤细胞为GBM12V的小鼠（低水平的EGFR配体）在Tofacitinib治疗后，肿瘤侵袭能力下降，小鼠生存率显著增加。

此外，Tofacitinib也增加了小鼠肿瘤的增殖能力。稳定敲降HB-EGF的GBM39细胞对Tofacitinib治疗更敏感。这些结果表明，Tofacitinib可能对EGFR配体水平较低的EGFR扩增的GBM肿瘤更有效。

在体内和体外实验中均证实了EGFR配体具有激活并逆转EGFR为抑癌基因的能力，为了在数据库中检测EGFR配体的表达情况，研究者进行了进一步的生信分析。

癌症基因组图谱（TCGA）数据显示，7个EGFR配体在GBM中有不同的表达，其中HB-EGF、TGF 和EGF是GBM中最丰富的配体，EGFR配体在非EGFR扩增的GBM中具有非常强的致癌作用（P=0.0009）。然而，在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体具有显著的抑癌作用（P=0.0355）。

由于EGFR配体在GBM发生发展中表现出的双重作用，研究者进一步探索了EGFR配体及相关蛋白与GBM患者预后之间的关系。

结果表明，当GBM患者肿瘤内EGFR配体水平较低时，肿瘤细胞内EGFR的激活方式主要为构成型信号传导，而这部分患者的预后也较差。此外，相比于EGFR磷酸化水平较低的患者，EGFR磷酸化水平较高的患者，预后更好（P=0.0254）。并且，在36个GBM样本中，随着BIN3蛋白水平的升高，患者预后逐渐改善。

同时，为了了解EGFR及配体在肿瘤内是否存在区域表达的差异，研究者开展了酶联免疫吸附试验（ELISA）。

结果表明，在36个切除的GBM样本中，EGFR的表达在肿瘤区域之间没有显著差异，然而，HB-EGF在肿瘤中心部分的表达水平却更高，它也是这36个样本中最丰富的EGFR配体。更进一步的是，已有研究发现Sp1能促进HB-EGF的转录，Sp1的过表达上调了HB-EGF的表达水平[12]。同时，Sp1与HB-EGF共同定位于肿瘤组织相同的区域，这表明转录因子可能参与调节了EGFR配体的区域表达。

总的来说，这项研究表明在EGFR扩增的GBM中，EGFR配体激活EGFR并抑制肿瘤细胞侵袭，将EGFR的作用从致癌基因转变为抑癌基因，而这依赖于配体诱导的EGFR激活，上调BIN3并抑制DOCK7-RhoGTPase信号通路来实现。

这意味着，基于EGFR和EGFR配体水平的患者分层，可能有助于预测能从靶向EGFR中获益的患者亚群。

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