细胞研究:建立小鼠染色体融合模型并模拟染色体的进化

《细胞研究》在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)李劲松研究组撰写的题为《小鼠人工核型的创造奖励基因组组织的稳健性》的论文。基于准精子介导的半克隆技术，CRISPR/Cas9靶向染色体重复序列，实现了小鼠染色体融合，建立了新的稳定传递染色体修饰的纯小鼠品系。揭示了染色体融合的机制，真核生物基因组组装的稳健性是染色体进化的重要基础。

染色体的稳定和变化是个体生存和物种进化的基础，也是遗传物质宏观调控规律的两面性。染色体数目和结构的变异对个体产生不利影响，新物种的形成往往伴随着复杂的染色体结构进化。根据系统的研究，大约在300 ~ 400万年前，人类和黑猩猩的共同祖先在染色体结构上出现差异，两条独立的染色体头对头融合(类似罗伯逊易位)成为现代人的第二条染色体(HSA2)，这可能直接导致人类祖先和黑猩猩祖先之间的生殖隔离，成为人类物种进化的关键事件。但这一事件的具体机制尚不清楚。

实验小鼠(Mus musculus)的核型为40条染色体，在长期繁殖过程中保持染色体数量和结构的稳定。除了Y染色体，其他都是着丝粒染色体(单臂染色体)，和人类的染色体有很大区别。人类染色体中没有发现着丝粒染色体，但都是以双臂染色体的形式存在(包括近端着丝粒染色体)。然而，在自然界中，野生小鼠的染色体罗氏易位(着丝粒染色体头对头融合)亚种种类繁多，但罗氏易位类型分布不均。比如Rb (2，4)(2号和4号染色体融合)和Rb (5，15)的融合类型在亚洲、欧洲和美洲都有广泛的分布，但是Rb (1，13)和Rb(。这引起了一系列的思考，染色体融合是如何发生的？为什么小鼠的染色体进化会有着丝粒偏好？不同类型的染色体融合方法对细胞和个体的生命活动有影响吗？如何把老鼠的单臂染色体改造成更像人类染色体的双臂染色体？

2018年，中国科学家团队在国际上率先实现了基于酵母的大规模染色体修饰。酵母染色体通过头尾融合合二为一，为染色体重排修饰的研究打开了一扇窗。然而，面对更复杂的哺乳动物，在个体水平上修改染色体在技术上是困难和具有挑战性的。今天，单基因突变和多基因突变遗传可以高效地建模，克服哺乳动物染色体结构变异的建模是一项重要任务。中国科学家独创的类精子干细胞技术，为实现哺乳动物个体染色体转化投下了一盏明灯。2022年8月26日，中国科学院动物研究所团队利用类似头尾融合的方法，获得了3只拥有19对染色体的小鼠(科学)。

李劲松团队为着丝粒核心基序小卫星(MinSat)设计了基于CRISPR/Cas9的靶向编辑方案，实现了着丝粒区域的靶向切割。将这种着丝粒靶向切割系统转染到小鼠类精子干细胞中，可以实现着丝粒区两条小鼠染色体头对头融合的罗氏易位，形成双臂染色体，模拟自然界漫长进化过程中的染色体重排事件。在着丝粒切割模块转染的1128株单克隆细胞系中，建立了10株稳定染色体的单倍体细胞系，其中9株保持了基因组倍性的平衡。

染色体着丝粒断裂并融合形成新的着丝粒。发现小鼠2号染色体(Chr2)罗氏移位后形成的所有双臂染色体都有两个独立的着丝粒(MinSat富集区)。进一步分析发现，小鼠Chr2不同于其他染色体，即在染色体末端有两个着丝粒。双着丝点染色体会造成有丝分裂不稳定，容易造成染色体断裂和基因组不稳定。进一步分析表明，小鼠Chr2有一个激活的着丝粒和一个失活的着丝粒。这表明，与其他染色体相比，小鼠Chr2染色体在进化过程中具有特殊的着丝粒形成事件。

染色体融合事件对细胞生命活动有什么影响？对具有不同Roche易位的细胞系进行转录组测序分析表明，具有单个Roche易位染色体的类精子干细胞仅有不超过20个差异基因，这表明染色体的头对头融合模式对细胞表达谱的扰动很小，差异基因分布在参与融合的染色体和不参与融合的其他染色体上。

考虑到三维基因组结构对转录调控和进化的重要性，研究了染色体融合对三维基因组结构的影响。与野生型细胞系相比，Roche易位细胞系在a/b比较中与TAD高度相似。此外，在罗氏易位细胞系和野生型细胞系中可以同时检测到近90%的染色质相互作用。染色体融合直接拉入两条染色体之间的物理距离，说明两条染色体之间的相互作用更加频繁。在着丝粒区和端粒区，这种相互作用更加明显。还发现，小鼠Chr11与其他染色体之间的相互作用在染色体融合后表现出强烈的变化，即使它不参与染色体融合事件。染色体融合对基因组结构和基因表达调控的影响很小，说明细胞内存在稳定的基因组结构和表达调控，体现了系统的鲁棒性。

类精子干细胞具有使卵母细胞而不是精子受精的能力。将染色体融合的类精子干细胞注射到卵子中后，可以产生健康的半克隆小鼠，并且可以繁殖它们。

进一步，研究尝试了在单重染色体融合的类精子干细胞上进行叠加切割，产生了二重甚至三重染色体融合的类精子干细胞。随着染色体融合事件的叠加，细胞差异基因数目逐渐增加，这些基因同样分布在参与融合和未参与融合的染色体上，这暗示了染色体融合事件的累积带来转录组整体水平的扰动。多重融合的类精子干细胞作为父源遗传物质供体依然可以支持半克隆小鼠的产生，一步实现多重染色体融合小鼠模型的建立。

本研究证实着丝粒的断裂导致的染色体融合是染色体演化的原因、真核生物基因组组装的系统稳健性（Robustness）是染色体演化的重要基础。该研究为哺乳动物进行染色体结构的改造、动物新核型亚种的创造以及染色体结构变异疾病的模拟提供了可行的技术路线，开启了以小鼠为代表的哺乳动物染色体遗传改造的新领域。

研究工作得到科技部、国家、中科院及上海市科学技术委员会等的资助，并获得分子细胞卓越中心动物实验技术平台和细胞分析技术平台的支持。

类精子干细胞中小鼠二号染色体和X染色体以头对头形式融合形成双臂染色体（红色：端粒；白色：着丝粒：绿色：近着丝粒）