Sci Adv：徐勇/何彦林合作神经元中雌激素受体α介导的快速兴奋激活机制

研究团队首先通过邻近生物素鉴定和质谱相结合的方法（BioID-MS）筛选出能够与ER 蛋白相结合的蛋白。在其中98个已知的膜蛋白中，研究团队注意到了Clic1这一氯离子通道蛋白，并用共沉淀（co-IP）方法证明了Clic1和ER 蛋白的相互结合，且E2能够增强二者的相互作用。进一步的研究利用ER 点突变ER -C451A，使得膜蛋白ER 减少而保留了ER 的核受体功能。结果显示Clic1和ER -C451A的相互作用显著降低，从而确定了Clic1更优先同膜上的ER 受体结合。

为进一步研究Clic1是否参与E2-ER 对神经元的快速兴奋的调控，研究人员采用了ER -ZsGreen小鼠模型，该小鼠大脑中表达ER 的神经元全部被绿色荧光所标记，再结合电生理技术直接找到并记录ER 神经元，进而研究E2-ER -Clic1如何调控神经元快速兴奋。该研究团队此前发表的研究工作证明E2能够快速兴奋位于下丘脑腹内侧核的腹外侧区域的ER神经元（ER vlVMH），并且该作用能够被ER -C451A突变消除。因此，在本研究课题中，实验团队希望通过ER vlVMH神经元来研究E2-ER -Clic1在神经元快速兴奋中的作用。

首先，通过离体脑片电生理记录ER vlVMH神经元，研究团队记录到了Clic1通道介导的电流，这部分电流可以被Clic1 特异的抑制剂IAA-94阻断。相对于对照组（vehicle），外源性E2可以显著增加ER vlVMH神经元中的Clic1通道介导的电流信号。进一步的研究结果表明，失去内源E2的雌性小鼠（卵巢切除，OVX）的ER vlVMH神经元，其Clic1通道介导的电流显著小于其对照组（保留卵巢，sham）。其次，研究人员利用了Cre-LoxP和Cas9/sgRNA技术，在ER -Cre小鼠模型中特异性地从ER vlVMH神经元中敲除Clic1基因，而后记录并比较E2诱导的ER vlVMH神经元兴奋性，实验结果表明，在被敲除Clic1基因的ER vlVMH神经元中，E2诱导的神经元快速兴奋被消除。

这一结果证实了Clic1参与调节E2-ER 诱导的快速神经元兴奋。而ER 在大脑的不同区域均有表达，为进一步确定E2-ER -Clic1对神经元快速兴奋调控的广泛性，研究团队对其他多个不同大脑区域进行了神经元记录与比较，包括下丘脑弓状核（ARH），内侧杏仁核（MeA），终纹床核（BNST），下丘脑外侧（LH）和下丘脑视前区（POAH），均得到了与ER vlVMH一致的结果，实验结果表明Clic1是多个脑区中E2-ER 诱导的快速神经元兴奋的共同离子机制。

最后，研究人员通过在体小鼠实验来检验神经元中Clic1的生物学功能。许多研究表明ER vlVMH和ER ARH神经元调控E2相关的能量代谢，研究团队特异性地从小鼠的ER vlVMH和ER ARH神经元中敲除Clic1基因，同时通过卵巢切除手术（OVX）去除内源E2和外源E2补充相结合的技术，从而得到四组小鼠：对照组OVX-V，对照组OVX-E2，Clic1敲除OVX-V和Clic1敲除OVX-E2。通过对这四组小鼠能量代谢相关表型的监测而确定 Clic1在能量代谢中的功能。结果表明Clic1的缺失使得小鼠对由OVX引起的肥胖不敏感，且抑制外源E2的抗肥胖作用。这部分实验结果表明，在雌性小鼠中，ER vlVMH和ER ARH神经元中的Clic1能参与调控由E2水平变化而产生的能量代谢影响。

综上所述，该研究结合BioID-MS，离体电生理记录，转基因小鼠模型，Cre-LoxP和Cas9/sgRNA等技术发现并证明Clic1 通过直接结合ER ，而实现E2诱导的快速神经元兴奋的离子机制且该机制普遍存在于多个脑区的ER 神经元。并且，E2-ER -Clic1这一离子通道调节ER 神经元兴奋性的生理学机制，也参与雌性小鼠的能量代谢调控。