Sci Adv:徐勇/何彦林合作神经元中雌激素受体α介导的快速兴奋激活机制 |
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研究团队首先通过邻近生物素鉴定和质谱相结合的方法(BioID-MS)筛选出能够与ER 蛋白相结合的蛋白。在其中98个已知的膜蛋白中,研究团队注意到了Clic1这一氯离子通道蛋白,并用共沉淀(co-IP)方法证明了Clic1和ER 蛋白的相互结合,且E2能够增强二者的相互作用。进一步的研究利用ER 点突变ER -C451A,使得膜蛋白ER 减少而保留了ER 的核受体功能。结果显示Clic1和ER -C451A的相互作用显著降低,从而确定了Clic1更优先同膜上的ER 受体结合。
为进一步研究Clic1是否参与E2-ER 对神经元的快速兴奋的调控,研究人员采用了ER -ZsGreen小鼠模型,该小鼠大脑中表达ER 的神经元全部被绿色荧光所标记,再结合电生理技术直接找到并记录ER 神经元,进而研究E2-ER -Clic1如何调控神经元快速兴奋。该研究团队此前发表的研究工作证明E2能够快速兴奋位于下丘脑腹内侧核的腹外侧区域的ER神经元(ER vlVMH),并且该作用能够被ER -C451A突变消除。因此,在本研究课题中,实验团队希望通过ER vlVMH神经元来研究E2-ER -Clic1在神经元快速兴奋中的作用。
首先,通过离体脑片电生理记录ER vlVMH神经元,研究团队记录到了Clic1通道介导的电流,这部分电流可以被Clic1 特异的抑制剂IAA-94阻断。相对于对照组(vehicle),外源性E2可以显著增加ER vlVMH神经元中的Clic1通道介导的电流信号。进一步的研究结果表明,失去内源E2的雌性小鼠(卵巢切除,OVX)的ER vlVMH神经元,其Clic1通道介导的电流显著小于其对照组(保留卵巢,sham)。其次,研究人员利用了Cre-LoxP和Cas9/sgRNA技术,在ER -Cre小鼠模型中特异性地从ER vlVMH神经元中敲除Clic1基因,而后记录并比较E2诱导的ER vlVMH神经元兴奋性,实验结果表明,在被敲除Clic1基因的ER vlVMH神经元中,E2诱导的神经元快速兴奋被消除。
这一结果证实了Clic1参与调节E2-ER 诱导的快速神经元兴奋。而ER 在大脑的不同区域均有表达,为进一步确定E2-ER -Clic1对神经元快速兴奋调控的广泛性,研究团队对其他多个不同大脑区域进行了神经元记录与比较,包括下丘脑弓状核(ARH),内侧杏仁核(MeA),终纹床核(BNST),下丘脑外侧(LH)和下丘脑视前区(POAH),均得到了与ER vlVMH一致的结果,实验结果表明Clic1是多个脑区中E2-ER 诱导的快速神经元兴奋的共同离子机制。
最后,研究人员通过在体小鼠实验来检验神经元中Clic1的生物学功能。许多研究表明ER vlVMH和ER ARH神经元调控E2相关的能量代谢,研究团队特异性地从小鼠的ER vlVMH和ER ARH神经元中敲除Clic1基因,同时通过卵巢切除手术(OVX)去除内源E2和外源E2补充相结合的技术,从而得到四组小鼠:对照组OVX-V,对照组OVX-E2,Clic1敲除OVX-V和Clic1敲除OVX-E2。通过对这四组小鼠能量代谢相关表型的监测而确定 Clic1在能量代谢中的功能。结果表明Clic1的缺失使得小鼠对由OVX引起的肥胖不敏感,且抑制外源E2的抗肥胖作用。这部分实验结果表明,在雌性小鼠中,ER vlVMH和ER ARH神经元中的Clic1能参与调控由E2水平变化而产生的能量代谢影响。
综上所述,该研究结合BioID-MS,离体电生理记录,转基因小鼠模型,Cre-LoxP和Cas9/sgRNA等技术发现并证明Clic1 通过直接结合ER ,而实现E2诱导的快速神经元兴奋的离子机制且该机制普遍存在于多个脑区的ER 神经元。并且,E2-ER -Clic1这一离子通道调节ER 神经元兴奋性的生理学机制,也参与雌性小鼠的能量代谢调控。
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