Nature Methods：能否通过数学模型揭示细胞周期的真实速度？VeloCycle有答案

VeloCycle的原理与创新

VeloCycle的核心创新在于将基因表达状态映射到低维的流形上，再在流形上进行速度场的学习。流形（Manifold）可以理解为一个低维的几何空间，能够描述细胞基因表达状态的复杂变化。通过将RNA速度估计与低维流形相结合，VeloCycle可以保证速度向量在几何上保持一致，从而提高模型的准确性。

在数学上，VeloCycle基于贝叶斯生成模型，将细胞在基因表达空间中的运动描述为流形上的点的变化。研究人员通过随机变分推断（Stochastic Variational Inference, SVI）对模型的参数进行估计，并且利用了Pyro这一概率编程语言来实现这些推断过程。在对基因的速度参数（例如剪接速率 和降解速率 ）进行估计时，VeloCycle可以将这些参数与低维流形上的坐标联系起来，从而实现统一的动力学推断。

基于流形约束的RNA速度统计推断框架用于细胞周期研究（Credit:Nature Methods）

VeloCycle方法的整体框架和不同步骤

a：联合框架的示意图，展示了基因表达流形（manifold）和RNA速度场（velocity field）的参数化联合框架。流形描述了基因表达在低维空间中的变化，而速度场则描述了基因表达变化的动态。

b：传统方法的无约束速度估计，对比展示了传统RNA速度推断方法的示意图，这些方法往往缺乏对速度方向的几何约束，导致速度估计在不同基因之间不一致。

c：概率关系的图模型，用板图（plate diagram）展示了潜在变量（如基因表达状态S和未拼接RNA状态U）与可观测数据之间的概率关系：S是基于期望值、流形坐标和流形几何参数采样得到的。U是基于流形信息、动力学参数（例如 和 ）以及速度函数采样得到的。坐标定义了每个细胞在潜在空间中的位置，几何形态定义了沿着流形的表达变化。

d：流形与速度公式化，上半部分描述了对于剪接转录本（spliced counts, s）的流形公式化，使用细胞特定的坐标（x）和基因特定的几何族（f）来直接映射观测数据到高维空间。下半部分描述了未剪接转录本（unspliced counts, u）的速度公式化，通过速度场函数（V）和相关的动力学参数（ , ）得到，最终通过对这些实体的求导（应用链式法则），将速度描述为流形坐标x(t)的直接函数。

e：周期性过程中的流形约束速度估计，描述了VeloCycle如何在周期性生物过程中的应用，首先通过流形学习估计坐标和几何，接着通过速度学习估计动力学参数和速度函数。

f：VeloCycle的新型速度分析类型，展示了VeloCycle可以实现的新型分析：统计显著性测试：在多个样本之间以及对照零假设进行的统计显著性测试。后验边际分布分析：通过马尔科夫链蒙特卡罗（MCMC）采样对模型参数进行后验分布分析。速度外推到真实生物时间：使用活细胞显微镜数据验证。从大参考数据集到小目标数据集的迁移学习：可以将基因流形从大型参考数据集迁移到较小的数据集。

VeloCycle的模拟数据与模型验证

为了验证VeloCycle的有效性，研究人员使用了模拟数据和真实的单细胞RNA测序数据进行对比。模拟数据的设计旨在保持基因之间的动力学参数关系，这些关系在真实数据中是被预期的。例如，模拟数据中包含3000个细胞和300个基因的20个数据集，VeloCycle在这些数据集上推断的细胞周期阶段与真实值的圆形相关系数为0.95，表明了模型的高准确性。

此外，研究人员还进行了敏感性分析，测试了VeloCycle在不同数据集规模上的表现。当细胞数量为100个或基因数量为100个时，VeloCycle仍然能够保持较高的推断准确性，其圆形相关系数大于0.70。这表明，即使在较小的数据集下，VeloCycle也能够稳定地进行细胞周期速度的估计。

在与DeepCycle这一基于自动编码器的方法的对比中，VeloCycle在多次模拟中的平均均方误差（MSE）比DeepCycle低60%，且相关系数r为0.95，而DeepCycle的r值为0.73。这意味着VeloCycle在速度推断方面显著优于DeepCycle。

对细胞周期速度的估计与生物学验证

VeloCycle的另一个重要应用是在细胞周期速度的估计上。在对人类视网膜色素上皮细胞（RPE1细胞）进行研究时，VeloCycle推断的细胞周期持续时间约为17.7小时，这与通过时间延迟显微镜对同一细胞的实验测量值（17.7小时，标准差为3.4小时）非常接近。这一结果表明，VeloCycle在对细胞周期速度进行推断时，与实际的实验数据有很好的吻合度。

研究人员还在小鼠胚胎（mES细胞）上测试了VeloCycle，这是一种快速循环的细胞类型。VeloCycle推断出其平均细胞周期为10.5小时，这一估计与快速循环细胞的生物学特征高度一致。

敏感性分析与模型的鲁棒性

为了确保VeloCycle模型在不同情境下的可靠性，研究人员对其进行了全面的敏感性分析。例如，在真实速度值变化的情况下，VeloCycle仍然能够保持稳定的推断性能，且估计结果与真实值的偏差在0.2%到35.8%之间。对于速度较慢的情况，推断误差有所增加，这可能是由于较短的未拼接和拼接RNA之间的延迟难以准确刻画。然而，在所有模拟数据中，VeloCycle对于剪接和降解速率的比值的估计几乎完全匹配真实值，其平均相关系数为0.99。

此外，研究人员还验证了数据集的规模对模型的影响。结果表明，数据集中的细胞数量和基因数量对模型的准确性有显著影响。使用更多的细胞可以弥补基因数量的不足，反之亦然。研究人员建议，对于准确的速度估计，至少需要500个细胞和50个基因，或350个基因和50个细胞。

VeloCycle的强大之处在于其不仅能够用于模拟数据，还可以应用于各种真实的生物数据集。例如，研究人员将VeloCycle应用于小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞的数据，这些数据来自不同的单细胞RNA测序技术和不同的生物样本。在所有这些数据集中，VeloCycle都能够成功地推断出细胞的周期状态，并且与现有的基于标记基因的分类结果高度一致。

在细胞周期速度的研究中，VeloCycle还展示了其在大规模基因敲除实验中的应用潜力。研究人员利用Perturb-seq数据集进行了实验，其中数百个基因敲除被引入RPE1细胞系。通过VeloCycle的推断，发现了一些特定基因敲除条件下细胞周期速度的显著变化，表明这些基因对细胞周期的进程具有重要影响。

VeloCycle为我们提供了一种全新的工具来研究细胞周期中的动态变化，通过结合低维流形学习与速度学习，它克服了传统RNA速度模型在统计和几何上的不一致性，为细胞周期的动力学推断提供了更加精确的手段。