Cell破译m⁶A谜团：不再是单一“自毁”，mRNA的生命周期藏着tRNA的“救援”

m⁶A的 神秘 位置：为何有的加速衰变，有的却稳定mRNA？

以往的研究发现，m⁶A修饰并非随机分布，它倾向于出现在mRNA的编码序列（Coding Sequence, 简称CDS）内部以及接近终止密码子（Stop Codon）的区域。但这种分布模式具体如何影响mRNA功能，我们并不完全清楚。

为了弄清楚m⁶A的位置效应，研究人员首先利用高分辨率的m⁶A图谱技术（miCLIP）在人HEK293T细胞中绘制了m⁶A的精确位置地图。通过将m⁶A位点明确划分到mRNA的不同区域（5 UTR, CDS, 3 UTR），他们发现：

那些mRNAs，如果它们的m⁶A位点仅位于3 UTR，它们的平均衰变速率并没有比没有m⁶A的mRNA更快，甚至在某些情况下，它们的稳定性略有增加。在人类细胞中，没有m⁶A的mRNA平均半衰期约7小时，而m⁶A仅在3 UTR的mRNA半衰期略长于7小时。

然而，如果mRNAs的m⁶A位点位于编码序列（CDS）内部，这些mRNAs的平均衰变速率则显著提高。在人类细胞中，m⁶A位于CDS的mRNA平均半衰期显著短于7小时，而在小鼠胚胎（mESCs）中也观察到了类似的模式。

这表明，m⁶A对mRNA衰变的影响并非一概而论，其位置至关重要。位于CDS的m⁶A才是加速mRNA衰变的主要 推手 。

进一步分析发现，高度不稳定的mRNA在CDS中富集了m⁶A，而稳定的mRNA的CDS区域m⁶A含量较低。这与m⁶A的 元基因 （metagene）分布模式相吻合，表明m⁶A在CDS区域的富集与mRNA的快速衰变密切相关。

为了在受控条件下验证这一结论，研究人员构建了一系列报告基因（Reporter Gene）。这些报告基因表达的mRNA经过精心设计，不含天然的m⁶A修饰位点，但在特定位置引入了可被甲基化的DRACH序列（m⁶A的识别基序）。他们构建了三种主要的报告mRNA：一种不含可甲基化位点作为对照；一种在CDS的末端（紧邻3 UTR之前）插入DRACH序列；另一种在3 UTR的起始位置插入DRACH序列。

当将这些报告基因转染到HEK293T细胞中，并阻断转录后，研究人员监测了报告mRNA的衰变速率。结果发现：

含有CDS m⁶A的报告mRNA的衰变速度最快，半衰期约为2.3小时（使用Actinomycin D阻断转录）或7小时（使用Triptolide阻断转录）。

对照报告mRNA（无m⁶A）的半衰期约为7小时（Actinomycin D）或19小时（Triptolide），比CDS m⁶A报告mRNA稳定得多。

含有3 UTR m⁶A的报告mRNA的半衰期约为3.4小时（Actinomycin D）或330小时（Triptolide），其稳定性介于前两者之间，且在Triptolide处理下甚至比无m⁶A报告mRNA更稳定（虽然Actinomycin D处理下略快，这可能与阻断机制差异有关）。

为了确认这种差异是由m⁶A修饰本身引起的，研究人员使用了METTL3抑制剂STM2457（METTL3是主要的m⁶A甲基转移酶）。STM2457处理后：

CDS m⁶A报告mRNA的衰变速度显著减慢，半衰期从7小时增加到5.9小时（Triptolide），变得与无m⁶A对照报告mRNA的6小时半衰期相似。

3 UTR m⁶A报告mRNA在STM2457处理后显示出稳定性增加，这与之前观察到的m⁶A在3 UTR的稳定作用一致。

这些实验有力地证明，m⁶A在编码序列（CDS）中的存在是导致mRNA快速衰变的关键因素。

翻译机器的 秘密 ：mRNA衰变与核糖体的速度之舞

为什么m⁶A在CDS会加速mRNA衰变呢？研究人员推测，这可能与mRNA的翻译过程紧密相关。核糖体是负责将mRNA序列翻译成蛋白质的 机器 ，它们沿着CDS前进。如果CDS上的m⁶A影响了核糖体的运动速度，这或许会引发下游的衰变机制。

为了验证翻译是否是m⁶A介导的mRNA衰变所必需的，研究人员使用了翻译抑制剂（如cycloheximide和emetine）处理了表达报告基因的HEK293T细胞。结果显示：

无论是使用cycloheximide还是emetine，含有CDS m⁶A的报告mRNA的衰变速度都显著减慢，其稳定性大大提高。这强烈支持CDS m⁶A介导的衰变是翻译依赖性的。

其他报告mRNA（无m⁶A或3 UTR m⁶A）的稳定性也有所提高，但效果不如CDS m⁶A报告mRNA那样显著和一致。

随后，研究人员将目光转向了内源性（细胞自身）的m⁶A靶mRNA。他们分析了在emetine处理的小鼠胚胎干细胞中，内源性mRNAs的衰变速率。结果发现：

与未处理的细胞相比，在emetine处理的细胞中，CDS区域含有m⁶A的mRNA的稳定性提高最多，其稳定性与不含m⁶A的mRNA相当。

进一步对人HEK293T细胞的数据分析也发现，mRNA的m⁶A水平（特别是CDS中的m⁶A）与其在emetine处理后的稳定性高度相关，相关系数平方（R ）约为0.66，显示出很强的线性关系。虽然单个mRNA的稳定性变化可能不大，但这种关联在转录组水平上普遍存在，超过20%的基因表现出超过20%的稳定性提高。

这些结果表明，m⁶A介导的mRNA衰变严重依赖于mRNA的翻译过程。这提出了一个重要的假说：CDS中的m⁶A可能通过影响核糖体的翻译速度来调控mRNA的衰变。

m⁶A如何 绊倒 核糖体：解码效率的微调

如果翻译是关键，那么m⁶A具体是如何影响核糖体的呢？一种可能性是，m⁶A修饰的密码子在核糖体翻译过程中被 低效 解码，导致核糖体速度减慢，甚至 暂停 。我们知道，低效的密码子（Non-optimal codons）会减慢翻译速度，并且与mRNA半衰期缩短有关。早期体外实验也显示，m⁶A可以干扰细菌核糖体对tRNA的识别。

为了在活细胞中验证这一假说，研究人员结合了m⁶A高分辨率图谱和核糖体分析技术（Ribosome Profiling）。核糖体分析可以捕捉mRNA上被核糖体保护的片段，从而揭示核糖体在mRNA上的位置和密度。核糖体停留在某个密码子上的时间越长，该密码子的A位点（Aminoacyl-tRNA binding site）的覆盖度就越高，这通常意味着该密码子正在被低效解码。

研究人员首先在HEK293T细胞中鉴定了被m⁶A修饰的密码子，并进行了核糖体分析。为了排除不同mRNA之间密码子使用频率差异带来的偏差，他们采取了严格的对照策略：对于每一个m⁶A修饰的密码子，都找到了同一mRNA中最近的、未被m⁶A修饰的同类型密码子进行比较。

比较结果显示：

与未被修饰的同类型密码子相比，m⁶A修饰的密码子在核糖体A位点的覆盖度显著更高，表明这些密码子在活细胞中确实被低效解码了。

这种低效解码效应并非由m⁶A结合蛋白引起，通过分析核糖体在m⁶A位点附近的阅读框偏移，研究人员确认核糖体是停留在m⁶A所在的密码子上，而不是在其他位置，这符合解码效率降低的模式。

为了进一步确认这种低效解码是m⁶A本身造成的，研究人员使用了METTL3抑制剂STM2457处理HEK293T细胞，抑制m⁶A的形成，并再次进行核糖体分析。结果令人惊叹：

在STM2457处理后，原本被m⁶A修饰的密码子在核糖体A位点的覆盖度显著降低，回到了未修饰密码子的基线水平。

此外，通过计算单个密码子的m⁶A化学计量度（即该密码子被m⁶A修饰的比例），研究人员发现在未处理的细胞中，m⁶A化学计量度与密码子A位点覆盖度之间存在强烈的正相关关系（R 约为0.66）。而在STM2457处理的细胞中，这种相关性几乎完全消失（R 小于0.01）。

这些数据有力地证明，m⁶A修饰确实会降低哺乳动物核糖体对密码子的解码效率，导致核糖体在含有m⁶A的密码子处减速。

密码 不是铁板一块：m⁶A对不同密码子的区别对待

m⁶A的识别基序通常是DRACH序列，它可以存在于九种不同的有义密码子（Sense Codons）中。研究人员进一步探究了这九种可被甲基化的密码子是否受到m⁶A的同等影响。

他们分析了这些密码子在被m⁶A修饰后的A位点覆盖度。结果发现：

在这九种密码子中，有八种在被m⁶A修饰后，其A位点覆盖度都有所增加，表明普遍存在低效解码现象。

然而，不同密码子受到的影响程度差异巨大。例如，GGA密码子即使被甲基化，其A位点覆盖度变化很小；而GAA密码子即使未甲基化时覆盖度已较高，被m⁶A修饰后覆盖度进一步显著增加。

这种差异是为什么呢？研究人员推测这可能与密码子-反密码子（Codon-Anticodon）相互作用的强度有关。GGA密码子与tRNA的反密码子通过沃森-克里克（Watson-Crick）碱基配对形成三个氢键，是一种固有强相互作用的密码子。而GAA密码子形成一个G-C碱基对，相互作用强度中等。看起来，m⁶A对密码子的影响程度，与其固有的密码子-反密码子相互作用强度有关，对于相互作用中等强度的密码子，m⁶A的 减速 效应更为明显。在STM2457处理后，这些密码子（特别是那些对m⁶A敏感的）的A位点覆盖度增加效应几乎完全逆转，再次确认这是m⁶A本身的作用。

因此，m⁶A对不同密码子的解码效率影响是存在差异的，这种差异性取决于密码子-反密码子相互作用的强度。

tRNA的 救援 ：mcm⁵s U如何解除m⁶A的 减速 魔咒？

我们知道，tRNA上的化学修饰会影响其对mRNA密码子的解码效率。研究人员注意到，m⁶A位于密码子的第三位（即 摆动 位置，Wobble Position）时，引起的核糖体暂停效应比m⁶A位于前两位时更强。而沃森-克里克碱基配对规律允许反密码子的第三位（U34）与密码子的第三位（ 摆动 碱基）进行非沃森-克里克配对。恰好，某些tRNA在U34位点含有修饰 5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷 （5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine, 简称 mcm⁵s U）。mcm⁵s U修饰已知可以提高解码效率。

这让研究人员产生了一个大胆的猜想：tRNA上的 mcm⁵s U修饰，是否能够 救援 或缓解m⁶A修饰密码子的低效解码？

为了验证这一猜想，研究人员构建了敲除ELP1或CTU2基因的HEK293T细胞系。ELP1和CTU2是mcm⁵s U生物合成途径中的关键酶。敲除这些基因会导致tRNA缺乏mcm⁵s U修饰。他们确认了敲除细胞系中tRNA缺乏mcm⁵s U修饰，并再次进行了核糖体分析。

他们特别关注了那些既能被m⁶A修饰，又被含有mcm⁵s U的tRNA解码的密码子，例如AAA、AGA和GAA。对这些密码子在野生型（WT）细胞以及ELP1 KO和CTU2 KO细胞中的A位点覆盖度进行分析后发现：

在缺乏mcm⁵s U修饰的ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，m⁶A化学计量度与这些密码子的A位点覆盖度之间的相关性显著增强。

特别是对于AGA密码子，在野生型细胞中m⁶A对其影响不大，但在缺乏mcm⁵s U的细胞中，m⁶A导致了强烈的核糖体暂停。这表明AGA密码子对mcm⁵s U的缺乏特别敏感。

这种现象在STM2457处理的细胞中被逆转，再次确认这是m⁶A与mcm⁵s U相互作用的结果。

这些结果表明，m⁶A和mcm⁵s U这两种在不同RNA分子上的修饰，在翻译核糖体的A位点上存在功能性相互作用，mcm⁵s U能够缓解m⁶A对密码子解码效率的降低作用。

低效解码往往会导致核糖体 碰撞 （Ribosome Collisions），即一个核糖体在前面慢速或暂停时，后面的核糖体赶上来发生碰撞。核糖体碰撞被认为是激活mRNA衰变机制（如无停顿衰变No-Go Decay）的信号。研究人员也检测了在不同细胞系中m⁶A修饰密码子处的核糖体碰撞情况：

在野生型细胞中，AGA和GAA等对m⁶A敏感的密码子处检测到了核糖体碰撞。

这种碰撞在STM2457处理后减少，确认是由m⁶A引起的。

更重要的是，在缺乏mcm⁵s U的细胞中，AGA和GAA密码子处的核糖体碰撞显著增加。

这些数据绘制出了一幅清晰的图景：m⁶A修饰导致核糖体减速，特别是当tRNA缺乏mcm⁵s U 救援 时，减速更加严重，从而引发核糖体碰撞。这些局部的核糖体碰撞可能就是生理性的mRNA衰变信号。

双重调控的 管家 ：mcm⁵s U/m⁶A系统如何重要mRNA的命运

既然mcm⁵s U能够对抗m⁶A引起的低效解码，那么它是否也能影响m⁶A介导的mRNA衰变呢？研究人员回到了报告基因实验。他们构建了一个报告基因，其CDS中的DRACH位点包含一个AGA密码子。如前所述，AGA密码子的解码需要完整的mcm⁵s U修饰，且对mcm⁵s U缺乏非常敏感。

将这个含有AGA密码子的报告基因转染到野生型、ELP1 KO和CTU2 KO细胞中后，研究人员检测了报告mRNA的衰变速率：

在ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，报告mRNA的半衰期都比野生型细胞中缩短了，衰变速度加快。

这种加速衰变是由m⁶A驱动的，因为STM2457处理可以稳定报告mRNA。

这表明，缺乏mcm⁵s U确实会加速m⁶A修饰mRNA的衰变。

为了在全转录组水平上验证这一发现，研究人员使用了SLAM-seq技术测量了mcm⁵s U缺陷细胞中细胞内源性mRNAs的衰变速率。SLAM-seq可以通过标记新合成的RNA来区分新旧mRNA，从而更精确地测量衰变速率。

结果显示，在ELP1 KO和CTU2 KO细胞中，m⁶A修饰的mRNA的衰变确实加速了。这证明mcm⁵s U对m⁶A介导的内源性mRNA衰变具有抑制或缓解作用。缺乏mcm⁵s U会增强m⁶A的 破坏力 。

这两种RNA修饰之间的相互作用，构成了一个全新的mRNA衰变调控机制。研究人员称之为 泛表观转录组学 （Pan-epitranscriptomic）调控系统。这个系统就像一个 管家 ，协同管理着细胞内功能相关的mRNA 调控子 （Regulons）的命运。

那么，这个 管家 系统具体调控哪些重要的mRNA呢？研究人员分析了受mcm⁵s U/m⁶A系统调控的mRNA在标志性通路（Cancer Hallmark Pathways）中的富集情况。结果揭示了一个显著的差异：

负责细胞 内务管理 （Housekeeping）功能的代谢通路相关的mRNAs通常稳定，且CDS中的m⁶A含量较低。

然而，编码信号通路关键组分的mRNAs则含有高水平的m⁶A，且衰变速度快。这些富含m⁶A、快速衰变的信号通路mRNAs在emetine处理后稳定性显著提高，再次确认其衰变是翻译依赖的。

更重要的是，这些高度修饰、不稳定的信号通路mRNAs在缺乏mcm⁵s U的细胞中衰变速度进一步加快。

这意味着，m⁶A通过耦合翻译与快速衰变，来精确控制关键信号通路的表达。而mcm⁵s U则像一个 许可 （Licensing）机制，通过缓解m⁶A的负面影响，确保这些重要信号通路mRNA能够获得更持续的表达，不至于过快被降解。这个mcm⁵s U/m⁶A平衡系统，实际上是在微调这些紧密调控信号通路的mRNA的 寿命 。

当RNA修饰失衡，疾病 趁虚而入 ：mcm⁵s U/m⁶A与癌症

mcm⁵s U/m⁶A系统调控着信号通路mRNA的命运，而信号通路的异常是癌症的标志。早期研究已经表明，m⁶A促进多能性因子mRNA衰变，帮助干细胞分化；而mcm⁵s U则支持多能性因子表达，维持干细胞状态。持续表达多能性基因和致癌信号通路与肿瘤干性（Tumor Stemness）密切相关。这些都暗示mcm⁵s U/m⁶A系统可能在癌症中发挥作用。

研究人员分析了正常人体组织中mcm⁵s U和m⁶A生物合成相关基因的表达水平，发现mcm⁵s U生物合成基因相对于m⁶A生物合成基因的表达比例与组织的干性程度相关。

更有趣的是，对TCGA（癌症基因组图谱）泛癌数据集的分析显示：

与正常组织相比，多种肿瘤样本中都观察到mcm⁵s U与m⁶A生物合成相关基因表达比例的失衡，具体表现为mcm⁵s U相关基因表达相对于m⁶A相关基因升高。

这种mcm⁵s U/m⁶A比例的失衡（偏向mcm⁵s U）与肿瘤的侵袭性增加和预后不良有关。

这表明，肿瘤的发生和发展可能与mcm⁵s U/m⁶A 管家 系统的失衡有关。

为了进一步评估mcm⁵s U/m⁶A系统作为癌症生物标志物的潜力，研究人员在METABRIC患者队列中，计算了mcm⁵s U和m⁶A生物合成相关基因的表达水平对患者总生存期（Overall Survival）的单变量Cox比例风险模型。结果惊人地一致：

mcm⁵s U相关因子与患者风险增加相关（风险比 1，例如，mcm⁵s U硫化相关因子URM1、MOCS3、CTU1、CTU2的风险比分别为1.019、1.011、1.008、1.005，均大于1），这意味着这些基因的高表达预示着较差的预后。

而m⁶A相关因子（如METTL3、METTL14、WTAP等）与患者风险降低相关（风险比 1，例如，METTL3、METTL14、WTAP的风险比分别为0.986、0.989、0.992，均小于1），意味着这些基因的高表达与较好的预后相关。

这种与两者分子功能相反方向的关联，在独立的SCAN-B乳腺癌患者队列中也得到了验证，再次强调了mcm⁵s U/m⁶A系统失衡与乳腺癌患者预后不良之间的联系。

研究人员基于METABRIC队列的系数，构建了一个 泛表观转录组学基因表达评分 （Pan-epitranscriptomic Gene Expression Signature），用于预测患者预后。结果显示：

该评分能够显著区分不同预后风险的患者群体。

评分较高的患者组（代表mcm⁵s U相关基因表达相对较高）与较差的生存率显著相关（Log-rank检验p值小于0.0001）。

在不同的乳腺癌亚型中，这个评分在更具侵袭性的亚型（如Basal亚型）中显著升高。

这表明，mcm⁵s U/m⁶A平衡系统可能在多种人类癌症中发挥作用，并有望作为一个新的泛癌生物标志物，帮助评估肿瘤的侵袭性和患者预后。癌症中观察到的密码子偏好性（Codon Bias）变化，或许并非直接通过改变蛋白质合成速度起作用，而是通过调控mcm⁵s U/m⁶A系统来影响mRNA的周转。

这项开创性的研究揭示了一个全新的基因表达调控机制：mRNA上的m⁶A修饰和tRNA上的mcm⁵s U修饰并非各自为营，它们在翻译核糖体上 相遇 ，协同作用，精细地调控着细胞内重要mRNA的命运。m⁶A像是一个 减速带 ，让核糖体在CDS中停顿；mcm⁵s U则像一个 助推器 ，帮助tRNA更好地解码m⁶A修饰的密码子，缓解这种停顿。两者的平衡，决定了mRNA是快速衰变（m⁶A占优，特别是在mcm⁵s U不足时）还是相对稳定（mcm⁵s U有效 救援 ）。

这个 泛表观转录组学 调控系统，尤其对那些编码关键信号通路组分的快速衰变mRNA至关重要，确保了这些通路能够在需要时被激活，又能在完成任务后迅速 关闭 ，维持细胞的动态平衡。当mcm⁵s U/m⁶A的平衡被打破，偏向mcm⁵s U时，重要信号通路mRNA的寿命延长，可能导致信号通路过度激活，推动肿瘤的发生和发展，预示着更具侵袭性的疾病和不良预后。

这项发现不仅加深了我们对RNA修饰复杂性的理解，提供了一个解释m⁶A如何与翻译偶联调控衰变的新模型，也为癌症和治疗提供了新的视角。未来，深入研究这个mcm⁵s U/m⁶A系统如何精确识别靶标mRNA、如何与其他RNA结合蛋白（如YTHDF家族蛋白）协作或并行工作，以及如何利用这一系统失衡的特性进行干预，无疑是令人兴奋的研究方向。RNA的世界远比我们想象的更加精彩和复杂！

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