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Nature Methods:“鱼”与“熊掌”兼得?!MAPIT-seq,同时绘制单细胞RBP-RNA互作图谱与表达谱

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众里寻他千百度 :追踪RNA与蛋白质 情缘 的旧难题

要在一座拥有数百万居民的繁华城市(细胞)里,找到某位特定人物(目标RBP),并查出他在特定时间点都和谁(目标RNA)有过接触,这是一项多么艰巨的任务。过去,研究人员为此发明了多种技术。

其中最经典的技术之一是CLIP-seq(交联沉淀后测序)。它就像是给全城的居民拍一张 集体照 (紫外线交联),然后通过 人脸识别 (特异性抗体)找到目标人物,并将与他 手拉手 的人一同 剪 下来进行分析。CLIP-seq及其衍生技术(如iCLIP、eCLIP)极大地推动了我们对RBP-RNA相互作用的理解,但它也有着明显的 偶像包袱 :操作流程繁琐、耗时,且需要大量的细胞样本作为 底片 ,对于珍贵的临床样本或稀有的细胞群体来说,简直是 奢侈品 。更重要的是,这个过程会不可避免地丢失细胞内完整的转录组信息,我们只知道RBP和谁 牵手 了,却错过了整个 派对 的盛况。

为了克服这些限制,TRIBE和STAMP等 无免疫沉淀(IP-free) 技术应运而生。它们采用了一种更 主动出击 的策略:将一种具有 编辑 能力的酶(如ADAR或APOBEC脱氨酶)与目标RBP融合在一起,在细胞内表达。这位 融合侦探 一旦接近目标RNA,就会在RNA上留下一个永久的 编辑标记 (例如将腺嘌呤A编辑成肌苷I,测序时读为鸟嘌呤G)。这样一来,只需对细胞内所有RNA进行测序,就能通过寻找这些 特殊标记 来反推RBP的 行踪 。这种方法巧妙地避免了免疫沉淀的繁琐,所需样本量也大大减少,甚至可以用于单细胞研究。但它的 阿喀琉斯之踵 在于需要对细胞进行基因改造,这对于原代细胞和临床组织样本来说几乎是 禁区 ,而且外源表达的 融合侦探 也可能干扰细胞正常的生理功能。

显然,我们需要一种更理想的工具:它既能摆脱基因改造的束缚,适用于各种类型的样本;又能以高灵敏度在细胞原位捕捉RBP与RNA的 亲密接触 ;最重要的是,它还能同时保留完整的转录组信息,让我们能够将 互动 与 场景 联系起来,真正实现 双线叙事 。MAPIT-seq,正是在这样的期盼中闪亮登场。

分子 GPS 与 编辑笔 :MAPIT-seq的巧妙设计

MAPIT-seq的全称是 modification added to RBP interacting transcript-sequencing ,其核心思想是利用抗体作为 分子GPS ,将RNA编辑酶精确制导到目标RBP的身边。整个过程如同一场精密的 分子侦察行动 。

第一步:锁定目标。研究人员首先使用温和的化学试剂(如0.5%的甲醛)对细胞或组织进行短暂固定。这一步至关重要,它就像按下了 暂停键 ,将细胞内所有瞬息万变的分子互动 定格 在发生的那一刻,完好地保存了RBP与RNA之间既强又弱的天然相互作用。同时,研究证实,这种温和的固定条件几乎不影响细胞的转录组全貌,与未经处理的细胞相比,其基因表达谱的皮尔逊相关系数高达0.98,确保了后续分析的真实性。

第二步:GPS制导。固定之后,细胞膜被打上微小的孔洞,允许 侦察兵 进入。首先登场的是一抗,这是一种能够特异性识别目标RBP的抗体,它像一枚高精度的 GPS定位器 ,迅速在细胞内找到并结合在目标RBP上。随后,二抗入场,它能识别并结合一抗,起到 信号放大器 的作用。

第三步:派遣 编辑专员 。整个技术最核心的 王牌 ,是一种经过巧妙设计和改造的重组蛋白。这种蛋白由三部分组成:首先是蛋白A/G(PAG),它能够强力结合二抗的 尾巴 ;其次是两种不同来源的RNA脱氨酶 人源的hADAR2dd和鼠源的rAPOBEC1。hADAR2dd擅长将RNA上的腺嘌呤(A)编辑成鸟嘌呤(G),而rAPOBEC1则偏好将胞嘧啶(C)编辑成尿嘧啶(U)。将这两种 编辑风格 不同的酶融合在一起,构成了一个 双核编辑引擎 ,极大地提升了标记的灵敏度和覆盖范围。这个融合蛋白被研究人员称为 pAG-deaminase 。当它被加入细胞后,PAG部分会迅速找到并结合在二抗上,从而将两个强大的 编辑笔 精确地带到目标RBP的 势力范围 内。

第四步:原位编辑与测序。在清除了所有未结合的 编辑专员 后,研究人员加入含有锌离子的缓冲液,激活脱氨酶的活性。在30 C下孵育3小时,这些近在咫尺的 编辑笔 就会在RBP周围的RNA 脚本 上留下大量的A-to-G和C-to-U 墨迹 。编辑完成后,研究人员提取细胞内的全部RNA,进行高通量测序。通过分析,这些被编辑过的位点就会在测序数据中以 突变 的形式显现出来。

最终,通过比较实验组(使用特异性抗体)和对照组(使用无特异性的IgG抗体)的编辑事件差异,研究人员就能精确地鉴定出哪些RNA是目标RBP的真正 邻居 ,并量化它们的 亲密程度 (MAPIT score)。由于整个过程保留了全部RNA,因此,一份MAPIT-seq数据同时提供了两个维度的信息:RBP-RNA互作图谱和全转录组表达谱。这种 一箭双雕 的能力,是MAPIT-seq最具革命性的地方。

严苛的 能力认证 :MAPIT-seq真的可靠吗?

一项新技术的诞生,必然要经过一系列严苛的考验来证明其可靠性和优越性。MAPIT-seq同样经历了这个过程,并且交出了一份令人信服的 答卷 。

特异性与灵敏度的双重验证:研究人员首先在一个经典的RBP G3BP1上测试了MAPIT-seq。G3BP1的RNA靶标已经被多种经典方法(如PAR-CLIP)广泛研究。结果显示,MAPIT-seq鉴定出的G3BP1靶标与PAR-CLIP的结果高度重合,在HEK293T细胞中,两者共同识别出了4,769个靶基因。不仅如此,MAPIT-seq似乎更倾向于发现那些结合得更紧密、更可信的靶标。进一步的敲低实验提供了更有力的证据:当细胞中的G3BP1蛋白被siRNA技术 沉默 后,原本在靶标RNA上观察到的丰富编辑信号显著下降。这表明MAPIT-seq的信号确实依赖于目标RBP的存在,具有很高的特异性。

广泛的适用性:为了证明MAPIT-seq并非只对G3BP1 情有独钟 ,研究人员将其应用到了多个功能各异的RBP上,包括剪接因子PTBP1和RBFOX2,以及在RNA稳定性调控中扮演重要角色的YTHDF2和PUM1。结果惊人地一致:对于每一个RBP,MAPIT-seq鉴定出的靶标都与已知的CLIP-seq数据表现出显著的重叠。例如,在RBFOX2的研究中,MAPIT-seq鉴定出的5,218个靶标与eCLIP鉴定的靶标高度吻合。这充分证明了MAPIT-seq是一种具有广泛适用性的平台技术。

高信噪比的优势:在与另一项新兴的原位编辑技术INSCRIBE的直接比较中,MAPIT-seq展现了更优越的性能。在针对RBFOX2的实验中,研究人员分析了两种方法在eCLIP已知的结合峰周围产生的编辑信号。数据显示,MAPIT-seq产生的信噪比(SNR)远高于INSCRIBE,这意味着它的信号更清晰,背景 噪音 更低,结果也更可靠。

解析结合密码:RBP识别RNA并非随意的 邂逅 ,而是遵循着特定的 接头暗号 即RNA上的短序列模体(motif)。一个强大的互作分析技术应该能够解析出这些 暗号 。MAPIT-seq不负众望。通过分析其鉴定出的高可信度编辑位点周围的序列,研究人员成功地为多个RBP找到了它们偏好的结合模体。例如,PTBP1的靶标富含CU序列,YTHDF2的靶标上则显著富集了GGAC模体,而RBFOX2的靶标则呈现出典型的UGCAUG模体。这些结果与之前的研究完全吻合,证明MAPIT-seq的分辨率足以揭示RBP识别RNA的序列密码。

拨开迷雾:用新工具裁决 学术公案

除了验证技术本身,MAPIT-seq的强大之处更在于它能被用来解决悬而未决的科学问题。一个典型的例子就是关于多梳抑制复合物2(Polycomb repressive complex 2, PRC2)是否结合RNA的长期争论。

PRC2是一个著名的染色质调控蛋白复合物,它的主要功能是在基因组的特定位置上添加H3K27me3这种抑制性组蛋白修饰,从而 关闭 基因的表达,在胚胎发育和细胞命运决定中扮演着 生死判官 的角色。过去有研究认为,PRC2可以广泛地结合多种RNA,尤其是长非编码RNA(lncRNA),并借助这些RNA分子在基因组上 导航 。然而,近期的另一项研究却使用更严谨的纯化方法提出了相反的证据,认为PRC2在体内根本不与RNA直接结合,之前的发现很可能是实验假象。

这场 公说公有理,婆说婆有理 的争论,让PRC2的真实身份变得扑朔迷离。MAPIT-seq的原位检测特性为解决这个 公案 提供了一个全新的视角,因为它能直接在细胞内部的天然环境中观察互作,最大限度地减少了细胞裂解和纯化过程可能带来的干扰。

研究人员在HEK293T细胞中,分别对PRC2的三个核心组分(EED、EZH2、SUZ12)进行了MAPIT-seq分析。为了确保实验的可靠性,他们还平行分析了两个已知的、与RNA有密切互动的蛋白 CHTOP和PTBP1。结果令人震撼:与CHTOP和PTBP1在数千个RNA上留下广泛编辑信号形成鲜明对比的是,PRC2的三个核心组分表现得异常 高冷 。在分析了超过一万三千个基因后,它们共同的靶标RNA只有一个 XIST。XIST是著名的与X染色体失活相关的长非编码RNA。这一清晰而明确的结果强烈地暗示,PRC2在通常情况下并非一个广泛的RNA结合蛋白,它可能只在非常特定的条件下,与像XIST这样特殊的RNA发生功能性互作。MAPIT-seq以其独特的数据,为这场长期的争论提供了一个有力的裁决。

深入 无人区 :在胚胎大脑中追踪发育的动态蓝图

生命科学研究的终极目标之一是理解复杂的生命过程,如胚胎发育。然而,在微小的胚胎组织中研究RBP的功能,尤其是早期胚胎,一直存在巨大的技术壁垒。传统的CLIP等方法需要大量组织,而基因编辑方法又不适用于活体。MAPIT-seq的出现,让这一切迎刃而解。

研究人员将目光投向了小鼠的胚胎大脑发育过程,这是一个受RBP精密调控的典型场景。他们成功地将MAPIT-seq技术应用于小鼠胚胎第10.5天(E10.5)的冰冻组织切片上,并对G3BP1蛋白的RNA互作网络进行了描绘。惊人的是,尽管G3BP1在整个胚胎中广泛表达,但MAPIT-seq的数据显示,在E10.5这个阶段,G3BP1结合的RNA靶标绝大多数都与神经系统的发育功能相关,如轴突发生(axonogenesis)和突触组织(synapse organization)。这与之前的功能研究结果高度吻合 敲除G3BP1的小鼠会表现出严重的大脑发育缺陷。

研究人员进一步将研究的时间线扩展到E12.5和E16.5这两个关键的神经发育窗口期。通过MAPIT-seq,他们不仅清晰地观察到了从 神经发生 到 胶质发生 的转变过程中的基因表达变化,还捕捉到了G3BP1结合靶标的动态变化。一个非常有趣的发现是,G3BP1在不同的发育阶段扮演着截然相反的角色。在E12.5,与G3BP1结合的靶标RNA丰度倾向于升高,暗示G3BP1可能在此时稳定这些RNA,促进其功能。然而到了E16.5,情况发生了反转,与G3BP1结合的靶标RNA丰度反而下降了,显示出抑制作用。这种 双面性 揭示了RBP在发育过程中调控作用的复杂性和动态性,而这正是过去的技术难以捕捉的。

终极视角:单细胞分辨率下的生命 纪录片

如果说在组织水平上研究RBP功能像是在看一部宏大的历史纪录片,那么单细胞分辨率的研究,则像是用显微镜头去追踪每一个历史人物的个人轨迹。将MAPIT-seq提升到单细胞水平(scMAPIT-seq),无疑是这项技术发展的巅峰。

实现scMAPIT-seq的最大挑战在于如何将固定的单细胞与高通量的单细胞测序平台兼容。研究人员通过测试不同的固定剂,最终发现DSP(dithiobis(succinimidyl propionate))这种可逆的交联剂是最佳选择。它既能有效固定细胞、保持较高的编辑信噪比,又能与10x Genomics等商业化单细胞测序流程完美对接。

在成功建立了scMAPIT-seq流程后,研究人员再次以G3BP1为目标,对HeLa细胞进行了分析。他们成功捕获了3,400个G3BP1-MAPIT细胞和3,945个IgG-MAPIT细胞。通过分析每个单细胞的转录组,他们可以清晰地将这些细胞划分到不同的细胞周期阶段:G1期、S期和G2/M期。

接下来就是见证奇迹的时刻。当他们把每个细胞的 RBP互作信息 与 细胞周期阶段 这两个维度的数据叠加在一起时,一幅前所未见的动态调控画卷徐徐展开。他们发现,G3BP1的结合靶标在不同的细胞周期中存在显著差异。例如,在G2/M期(有丝分裂期),G3BP1倾向于结合那些与有丝分裂和染色体分离密切相关的RNA。

更深一步的分析揭示了G3BP1的调控 天机 。通过计算G3BP1的结合强度与靶基因表达水平之间的相关性,研究人员将G3BP1的靶标分为了两类:正相关靶标和负相关靶标。对于正相关靶标,G3BP1的结合越强,其RNA水平越高,暗示G3BP1在稳定这些RNA。而对于负相关靶标,情况则相反。在随后的功能验证实验中,敲低G3BP1后,正相关靶标的表达水平果然显著下降,而负相关靶标的表达水平则显著上升。scMAPIT-seq不仅发现了这种差异调控,还为我们揭示了其背后的分子机制线索:正相关靶标通常含有更多的ARE(富含AU的元件),而负相关靶标则没有这个特征。

scMAPIT-seq以其无与伦比的 双组学 和单细胞分辨率,让我们第一次能够如此清晰地看到,在生命最基本的单元 单个细胞内部,一个RBP是如何根据细胞所处的不同生命阶段,动态地、差异化地去执行它的 导演 职责。

开启后转录组学研究的新纪元

从最初的概念设计,到在细胞系中的反复验证,再到在复杂组织和单细胞水平上的成功应用,MAPIT-seq技术展现了其作为下一代RBP-RNA互作研究工具的巨大潜力。它巧妙地结合了抗体的高特异性和酶催化的原位标记,摆脱了传统方法的诸多束缚,为我们提供了一个高分辨率、高灵敏度且信息丰富的 双维透镜 。

借助这面透镜,我们不仅能以前所未有的清晰度去描绘已知的生命蓝图,还能去探索未知的领域,裁决悬而未决的争议,甚至在动态的生命进程中捕捉那些稍纵即逝的调控瞬间。从胚胎发育到神经功能,从细胞周期到癌症进展,无数与RBP功能失调相关的生命谜题,正等待着被这把新的钥匙所开启。MAPIT-seq及其衍生的scMAPIT-seq、长读长MAPIT-seq,无疑将引领我们进入一个全新的后转录组学研究时代,一个我们能够真正 听见 细胞内每一个分子密语的时代。

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