该研究揭示了DNA复制检查点途径成员对DNA复制应激协同反应的分子机制

来源：深圳先进技术学院2021-12-14 08:24

中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所课题组甘海云在PNAS发表了题为《复制胁迫状态下芽殖酵母中Rad53耦联先导链和后随链DNA合成的机制》(rad 53偶联前导链和滞后链DNA合成的机制

中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、深圳合成生物学创新研究院甘海云研究组发表了题为《复制胁迫状态下芽殖中Rad53耦联先导链和后随链DNA合成的机制》(rad 53在萌芽年复制胁迫下偶联领先链和滞后链DNA合成的机制)》的论文，揭示了DNA复制检查点通路成员协同响应DNA复制胁迫的分子机制。

在细胞分裂前的物质准备过程中，需要复制遗传物质。以有丝分裂为例，遗传物质DNA的复制主要发生在分裂前的S期。DNA能否及时准确复制，不仅关系到细胞能否完成分裂，还关系到信息能否准确传递给后代细胞。但在DNA复制过程中，会出现一些影响复制的因素，如DNA损伤、脱氧核苷酸(dNTP)水平降低、转录复制机的遭遇等。这种现象被称为DNA复制应激。

为了应对复制应激，生物体进化出了一种检查点机制(图1):当DNA复制应激发生时，就会产生单链DNA。当传感器蛋白感应到单链DNA的存在时，就会激活激酶Mec1(哺乳动物中的同源蛋白是ATR)。Mec1被激活后，会通过磷酸化下游蛋白逐渐将信号传递给效应激酶Rad53(哺乳动物中的同源蛋白为Chk1)。激活后，激活的Rad53会对人类的活动产生负面影响。虽然Rad53早就被明确为应对DNA复制应激的检查点，但Rad53在这一过程中如何协调复制机器中更多蛋白质的具体分子机制仍不清楚。

自2014年起，甘海云致力于DNA复制机响应DNA复制应激机制的研究，并与合作者共同开发了eSPAN技术(Molecular Cell，2014)，使得在DNA复制过程中特异性检测前导链和后续链结合蛋白成为可能。Espan(蛋白质相关新生DNA的富集与测序)技术巧妙地将BrdU(脱氧核糖核苷类似物，溴脱氧核苷尿嘧啶)标记的新生儿DNA链富集技术与染色质免疫沉淀(ChIP)技术相结合，利用新生儿前导链与新生儿不同链向的特点，探索前导链与后续链中蛋白质的结合(图2)。

研究人员使用这项技术来比较和分析在正常的DNA复制和DNA复制压力下，前导链和后续链结合蛋白之间的异同。结合对比分析结果和相关研究结果发现，当细胞内dNTP水平降低，DNA复制处于应激状态时，位于滞后链上的PCNA会在检查点激酶Mec1和Rad53的控制下从滞后链上分离出来，维持复制应激状态下的基因组稳定性。此外，在不存在检查点激酶Rad53的情况下，通过该技术比较和分析复制叉及其结合蛋白。当检查点功能缺失且存在复制应激时，DNA复制解旋酶CMG复合物仍会推进并解开双链DNA，但前导链复制比滞后链慢，导致前导链单链区域大(以下简称不对称复制)(图3)。这表明，检查点激酶Rad53可以协调DNA解旋酶复合体与前导链和后续链的复制速度，从而防止大单链DNA暴露导致的复制叉塌陷和DNA损伤(Molecular Cell，2017)。

上述研究初步揭示了复制应激下检查点激酶Rad53对复制蛋白的调控机制。但是，由于Rad53位于复制检查点路径的下游位置，因此不清楚t

在这项研究中，甘海云团队解释了DNA复制的检查点通路成员对应激状态下复制叉状态的影响，发现检查点通路成员Mec1、Mrc1(哺乳动物中的同源蛋白为Claspin)在突变后与Rad53突变体(不对称复制)的表型高度一致，这表明DNA复制的检查点通路通过Rad53调控复制子蛋白。

此外，Mrc1具有检查点功能，直接参与DNA复制。当Mrc1检查点功能缺失时，细胞对复制应激反应的表型与Rad53突变体和Mec1突变体相同，而当Mrc1复制功能缺失时，不对称复制的表型消失。这表明Mrc1的复制功能可能是检查点Rad53的调节靶点。根据这一假设，进一步的实验发现，删除Rad53突变体中的Mrc1会使Rad53突变体的不对称分裂表型消失，初步证实了上述推测。

Mrc1通过与Tof1-Csm3形成复合物来执行其DNA复制功能。那么，Tof1是否参与了这个过程？进一步分析了Tof1突变体的表型，证实了Tof1在此调控途径中。到目前为止，这项研究已经分析了在复制压力下检查点蛋白如何调节DNA复制的分子机制。3354细胞感受到复制压力后，激活复制检查点通路Mec1 Mrc1 Rad53，激活的Rad53通过调节Mrc1-Tof1来协调前导链和后续链的复制，防止单链DNA导致基因组不稳定。(100yiyao.com)

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