研讨提醒Cas9切割DNA及其被AcrIIC3克制的分子机理

CRISPR/Cas零碎是普遍存在于和古菌中抵御病毒、质粒等外源核酸的取得性免疫零碎。II型的Cas9在RNA的介导下可以特异性辨认、切割dsDNA，具有可编纂性，是以被普遍用作基因编纂对象。因为其主要性，Cas9被零碎地研讨，年夜量的文献报道了Cas9的原子分辩率构造、单分子测量成果、分子动力学模仿盘算成果，说明了Cas9切割DNA的分子机理。然则，之前揭橥的Cas9构造中，切割目标DNA的HNH催化口袋远离切割位点，Cas9处于非活性的形态。而活性形态下的构造是真正懂得Cas9切割DNA的感化机制所必须的。别的，今朝被普遍应用的SpyCas9，因受其年夜小的限制，很难与sgRNA一路经过单一AAV病毒导入。而近年来新判定的NmeCas9则因为其绝对比拟小和脱靶率低的缘由，无望成为一个更好的编纂对象，但其分子机制尚未被提醒。噬菌体编码的具有克制CRISPR-Cas零碎功效的卵白被称为anti-CRISPR卵白，这些卵白可以作为基因编纂开关，调控Cas9的活性。2016年，多伦多年夜学Karen Maxwell课题组初次报道了AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3三种可以克制NmeCas9的anti-CRISPR卵白。王艳丽课题组曾与Maxwell课题组协作说明了AcrIIC2经过障碍Cas9与sgRNA的联合克制Cas9活性的机制；然则今朝AcrIIC3的克制机理还不清晰。10月24日，中国迷信院生物物理研讨所王艳丽课题组的研讨论文“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR Inhibited States”在Molecular Cell 杂志在线揭橥。该任务报道了NmeCas9的五种分歧的形态：sgRNA联合形态、种子区域配对形态、催化前形态、催化形态、切割后产品联合形态的高分辩率构造。这些构造好像片子一样，慢慢展现了Cas9切割目标DNA的每一个进程，同时提醒了两种分歧的NmeCas9辨认两种分歧PAM的分子机制，进一步提醒了Cas9切割DNA的分子机制。同时，该任务还报道了AcrIIC3辨别与sgRNA联合形态、DNA联合形态Nme1Cas9的复合物构造，提醒了AcrIIC3克制Nme1Cas9切割活性的分子机理。Cas9与sgRNA联合构成功效复合物，然后Cas9-sgRNA复合物读取目的DNA的PAM序列，解开目标DNA双螺旋，同时sgRNA和目标DNA配对，发生R-loop，随后Cas9的HNH与RuvC活性中间辨别割断DNA的两条链。该研讨中的种子区域配对形态的构造，胜利捕获到双螺旋构成的两头进程，即sgRNA辨认、联合目标DNA的形态（图1A）。更值得留意的是研讨者解析了Cas9 HNH处于催化形态的构造（图1B），并第一次不雅察到金属离子与HNH活性中间的联合。而上述这两种形态是初次被不雅测到。Cas9的HNH构造域具有十分高的柔性，并偏向处于远离切割位点的部位，使得Cas9易处于非活性形态。研讨者对HNH构造域停止改革，加强了HNH构造域与目标DNA的互相感化，进步了NmeCas9切割DNA的活性。同时，HNH的催化形态激活RuvC切割另一DNA链的活性。是以，HNH构造域改革后的Cas9切割目标DNA两条链的活性同时获得加强。为了说明AcrIIC3克制NmeCas9活性的分子机理，研讨者解析了AcrIIC3和联合sgRNA的NmeCas9构成复合物的构造，以及和联合了sgRNA、DNA的NmeCas9构成复合物的构造。研讨标明，两个AcrIIC3单体衔接两个NmeCas9复合物（图1C）。AcrIIC3与NmeCas9之间的互相感化将HNH构造域锚定在非活性形态，从而克制NmeCas9对DNA的切割。这项任务还给年夜家展现了两种NmeCas9切割DNA的两头形态以及产品联合形态，进一步论述了Cas9切割DNA的分子机理。须要指出的是，在论文评审进程中，Nature Structural Molecular Biology 杂志报道了处于切割后形态的SpyCas9三元复合物构造，全体分辩率3.37angstrom，然则部分的HNH分辩率比拟低。王艳丽组报道的催化形态中Cas9三元复合物构造的分辩率更高，为Cas9的改革与使用供给了更无力的实际根底；同时提醒了AcrIIC3克制NmeCas9切割双链DNA的分子机理。(100yiyao.com）