Science：全文解读!提醒Pax3 mRNA掌握肌肉干细胞命运机制

为了评价U1 snRNA在MuSC产生的选择性性聚腺苷酸化中的感化，Rando团队构建出在绿色荧光卵白编码基因下流表达Pax3 3"UTR的申报基因。敲降或过表达U1 snRNA辨别招致远端的扩增子（amplicon）削减或添加。为了评价U1 snRNA在体内的MuSC中的感化，他们应用AMO对小鼠停止全身性处置来敲降U1 snRNA。他们不雅察到肢体MuSC中较长的Pax3转录异构体降低了，但是，隔阂肌MuSC中没有这种分明变更。

为了测试U1 snRNA能否经过Pax3 3"UTR中的保守性联合基序调理Pax3转录异构体表达，Rando团队设计了与这些基序互补的AMO（下称U1位点AMO），以便在Pax3 3"UTR上与U1 snRNA竞争。他们在用这些AMO处置的小鼠中不雅察到向较短的Pax3转录异构体切换。接上去，他们设计了与比来端聚腺苷酸化位点中的两个症结保守序列互补的AMO（下称PAS1 AMO），以与症结的聚腺苷酸化因子竞争并选择一个更远端的聚腺苷酸化位点。他们不雅察到在用这些AMO处置的小鼠中，隔阂肌MuSC中更长的Pax3转录异构体添加了。他们得出的结论是U1 snRNA在体内引诱了MuSC中更长的Pax3转录异构体表达，而且它经过Pax3转录本中的保守性基序起感化。

U1 snRNA掌握Pax3的长度及其对miR206的敏理性，图片来自Science, 2019, doi:10.1126/science.aax1694。 接上去，Rando团队探求了Pax3转录异构体表达的变更能否招致Pax3卵白程度上的差别。鉴于只要较长的Pax3转录异构体包括miR206联合位点，是以只要这些较长的Pax3转录异构体对miR206程度变更敏感。他们用U1位点AMO或PAS1 AMO处置miR206敲除小鼠，然后用miR206模仿物转染纯化的MuSC。在体外培育24小时后，他们测量了Pax3卵白程度。在来自经由对比AMO处置的miR206敲除小鼠的肢体MuSC中（次要表达较长的Pax3转录异构体），与对比（miR1模仿物）比拟，miR206模仿物下降了Pax3卵白程度。比拟之下，来自用U1位点AMO处置的miR206敲除小鼠的肢体MuSC并未显示Pax3卵白程度的任何降低，而来自用PAS1 AMO处置的miR206敲除小鼠的肢体MuSC的确显示出对miR206作出反响而惹起的Pax3卵白程度激烈降低。他们在隔阂肌MuSC中不雅察到了相似的表达形式，它们在基线时次要表达较短的Pax3转录异构体。敲降或过表达U1 snRNA辨别招致来自野生型小鼠的MuSC中的Pax3卵白程度降低或降低，然则在来自miR206敲除小鼠的MuSC中则不会。

鉴于较长的Pax3转录异构体对miR206调理更敏感，Rando团队接上去测试了这种调理能否在体内产生。敲降U1 snRNA可招致野生型小鼠中的Pax3卵白程度呈剂量依附性添加，但在miR206敲除小鼠中则不会。他们随后用U1位点AMO和PAS1 AMO处置野生型小鼠。阻断U1 snRNA联合位点招致来自野生型小鼠的 MuSC中的Pax3卵白程度降低，然则在来自miR206敲除小鼠的MuSC中则不会；阻断PAS1会到Pax3卵白程度降低。他们得出的结论是U1 snRNA引诱切换到更长的Pax3转录异构体，从而招致miR206克制Pax3卵白表达。

接上去，Rando团队思索经过调理Pax3卵白程度，U1 snRNA能否也影响MuSC激活。他们用U1位点AMO或PAS1 AMO处置了miR206敲除小鼠，纯化出MuSC，并在EdU存鄙人用miR206转染它们。关于用PAS1 AMO处置的小鼠，miR206转染招致肢体MuSC和隔阂肌MuSC中的EdU掺入削减。关于用U1位点AMO处置的小鼠，miR206转染并未招致EdU掺入的变更。U1 snRNA的过表达招致来自野生型小鼠的MuSC中的EdU掺入程度降低，然则来自miR206敲除小鼠或Pax3cKO小鼠的MuSC中则不会。

为了供给进一步证据来证明U1 snRNA在掌握处于稳态前提下的MuSC激活中的感化，Rando团队用U1位点AMO或PAS1 AMO处置了野生型小鼠。阻断U1联合位点招致来自野生型小鼠的肢体MuSC和隔阂肌MuSC中的EdU掺入添加，而阻断近端聚腺苷酸化位点招致EdU掺入削减。然则，这些AMO对miR206敲除小鼠或Pax3cKO小鼠没有影响。这些数据标明，在稳态前提下，U1 snRNA经过Pax3的选择性多聚腺苷酸化感化掌握MuSC激活。

为了在体内探求Pax3在MuSC中的功效相干性，Rando团队前提性地剔除了3个月年夜小鼠的MuSC中的Pax3，在2周或9个月后，并未不雅察到MuSC的数目呈现差别。经过应用加强型黄色荧光卵白（eYFP）作为MuSC的一种谱系示踪剂，他们在9个月后在肌纤维中不雅察到分明的eYFP表达。在野生型小鼠的隔阂肌中年夜约50％的肌纤维呈阳性（即表达eYFP），在野生型小鼠的胫前肌（tibialis anterior）中，10％的肌纤维呈阳性，这与以前的报道相分歧。在这些经由前提性剔除Pax3的小鼠中，较少的隔阂肌纤维显示出与MuSC交融的证据。在这些小鼠中，他们不雅察到隔阂肌和三头肌而不是胫前肌中的肌纤维年夜小明显降低。与此相分歧的是，Pax3cKO小鼠显示出握力降低而且在跑步机测定中显示出较差的表示。他们得出的结论是，在MuSC表达高程度Pax3的肌肉中，Pax3表达关于这种组织的构造和功效坚持稳态至关主要。