金唯智新型技巧测通AAV

处理计划

为懂得决这一难题，GENEWIZ开辟了一种新型的AAV-ITR测序办法，可以改良ITR区域的测序旌旗灯号并延伸读取长度。

为了验证我们的ITR测序办法，将其与尺度办法停止比拟，我们起首应用BigDye cycle sequencing kit(Thermo Fisher)对含有AAV2 ITRs的质粒停止测序。不出所料，在ITR发夹构造开端处，测序旌旗灯号忽然降低(图2)，招致测序过早终止。添加罕见的添加剂，如DMSO和/或甜菜碱也不克不及改良这一成果(数据未显示)。

图2：应用BigDye cycle sequencing kit对AAV2的ITR区域停止测序

白色下划线标志序列后的碱基“TTGGC”是一个无法胜利测序的125 bp ITR发夹构造的开始。

而GENEWIZ的新型AAV-ITR测序办法可以测通ITR发夹构造而且在全部ITR区域没有分明的旌旗灯号丧失，到达了与惯例测序反响相似的读取长度(图3)。此外，我们还研讨了引物联合位点对ITR测序质量的影响。我们发明，当引物与ITR区域之间的间隔为150-350bp时，平日可以取得最佳的测序质量(数据未显示)。

图3：应用GENEWIZ ITR测序法测定AAV2的ITR区域的色谱图

白色下划线的序列表现图2中提到的雷同序列。黑框内显示完好的125bp ITR发夹构造。

rAAV质粒中ITR完好性的定性评价

今朝，rAAV质粒次要在细菌中扩增。但是，因为细菌中同源重组零碎，ITRs常常产生重排。细菌繁衍后，rAAV质粒中最罕见的渐变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺掉(图4)。这种缺掉使T型ITR发夹的茎更长，比野生型ITR加倍波动。在对数百条来自分歧细胞系中扩增的rAAV质粒停止测序后，我们发明，我们发明，GENEWIZ ITR测序办法可以测通野生型ITR序列(图4和图5A)以及更有挑衅性的缺掉渐变的ITR序列(图5B)，而且能协助定性评价ITR区域甚至是缺掉渐变ITR区域的完好性。

图4：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺掉的表示图

野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹构造，而缺掉渐变的ITR是一个103bp的发夹构造，其茎部更长。

图5：应用GENEWIZ ITR测序办法剖析rAAV质粒中ITRs的完好性

A) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定野生型AAV2 的ITR区域的色谱图。C-C’臂和B-B’臂辨别用白色和蓝色标出。B)GENEWIZ AAV-ITR测序法对AAV2的缺掉ITR区域停止色谱剖析。测序成果显示B-B’臂呈现缺掉。C) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定缺掉渐变的AAV2 ITR区域的色谱图。测序成果标明，该质粒是完好ITR和缺掉渐变ITR的混杂物。在155-157bp处的TTT峰与完好的ITR序列分歧，个中存在短少B-B’臂的质粒模板。

GENEWIZ AAV-ITR测序办法的优化

一些rAAV质粒在ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域(图6A)。现有的Sanger测序办法测通同聚物G区域十分艰苦，GENEWIZ的AAV-ITR测序办法也面对异样的艰苦。随同着Poly-G的测序进程，测序旌旗灯号值也逐步下降，并招致未测序至ITR发夹构造测序反响就提早终止 (图6B)。今朝尚未有适合的办法能处理poly-G区域对ITR发夹构造形成的热力学妨碍。然则，GENEWIZ的AAV-ITR测序办法能经过反向测通ITR发夹构造和poly-C反复区域(图6A)，进而进步该区域的数据质量及读取长度(图6C)。

图6：GENEWIZ的ITR测序法对含有poly-G序列的AAV质粒停止测序

A) ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域的表示图；黑色和绿色箭头辨别表现正向测序和反向测序。B)采取GENEWIZ的AAV-ITR测序

法，正向对同聚物G + ITR区域停止测序的色谱图。C)采取GENEWIZ的AAV-ITR测序法，反向对同聚物G + ITR区域停止测序的色谱图。

GENEWIZ的AAV-ITR测序办法能无效评价AAV质粒中ITR区域的完好性。它可以敏捷精确地检测到ITRs区域的渐变，为下流毛病的扫除节俭工夫和精神。我们选择了AAV2的ITR区域停止测试，由于AAV2是最典范的、最常用的AAV血清型。AAV分歧血清型含有类似的ITR序列，今朝我们正在对分歧AAV血清型的ITR区域停止测序以及包含其他的DNA病毒等。这种AAV-ITR区域的测序办法可以普遍使用于热力学波动的发夹构造的测序。

金唯智美国客户反应

订购流程：

1. 下载并填写《金唯智ITR测序送样单》并发送至邮箱：Support.Asia@genewiz.com.cn

2. 将样品按送样请求寄送或交给取样员

3. 等候AAV-ITR测序成果（3-5个任务日）