2021年4月CRISPR/Cas最新研讨停顿

图片来自Molecular Therapy, 2021, doi:10.1016/j.omtm.2021.03.025。

起首，作者引见了应用CRISPR / Cas9基因编纂技术对地中海血虚症患者进行医治的战略。起首，作者从患者体内提取获得了携带渐变特征的红细胞前体细胞，而且在不含匆匆红细胞天生素（EPO）的培育基中体外培育7天。之后向培育基中退出EPO以刺激细胞分解以及血红卵白的发生。3天后，向细胞直达染CRISPR-Cas9组件，而且持续培育5天。在此进程中，通过多种伎俩对细胞的基因组，转录组以及卵白质程度进行检测。

基因组程度检测成果标明，CRISPR-Cas9可能高效地修正地中海性血虚患者中相关基因的渐变。详细而言，β39渐变核苷酸为胸腺嘧啶（T），颠末编纂后胜利地转变为正常的胞嘧啶（C）。品貌阐发成果显示，在CRISPR-Cas9转染之后，至多4.5%的细胞中渐变位点获得了修正。进一步，作者检测了修正后的mRNA表白程度。RT-PCR检测成果标明：修正后的mRNA表白程度相比未处置组华夏始渐变mRNA，至多高8倍左右。

终极，作者通过WB以及HPLC技术，验证了基因编纂后的细胞可能天生正确的β-globin，标明其功效可能获得复原，此外，HbA卵白的表白也获得了显明的复原。

6.

doi:10.1016/j.molcel.2021.02.007

对CRISPR-Cas9技术的准确调控可以进步其在基因编纂方面的平安性和实用性，然而这一目的今朝却仍受 “不完整失活” 、 “速度过慢” 等缺陷的限定。为了降服这些阻碍，在比来一项研讨中，来自约翰霍普金斯年夜学的Taekjip Ha传授等人设计了光敏感、可裂解的guide RNA（pcRNA），从而可能应用光照到达降解sgRNA分子，进而调控Cas9核酸酶基因编纂活性的目标。相关成果颁发在比来的《Molecular Cell》杂志上。

起首，作者在gRNA分子中拔出了光敏可切割基团，构建出了pcRNA分子，进而在体外试验中验证了该修饰后的sgRNA是否受光照的调理。试验成果标明，在缺乏光照的环境下，pcRNA与cas9混合物可能高效地切割DNA底物。相反地，在承受350nm光照的环境下，DNA分子则简直没有遭到切割。光照30s就足以到达灭活sgDNA-cas9复合体活性的目标。此外，作者还证实了pcRNA分子同时可能兼容其它类型的CRISPC-cas9平台，例如单核酸碱基编纂。在转染了AncBE4max以及pcRNA分子的HEK293T细胞中，光照2分钟就足以起到灭活单碱基编纂活性的后果。

众所周知，中靶征象是基因组编纂技术中的难题，为了探求光敏基团修饰可否进步sgRNA-cas9靶向编纂的特同性，作者检测了基因组中VEGFA2以及HEK4等中靶位点的胞嘧啶渐变效应。成果显示，在共转染pcRNA与cas9/AncBE4max的HEK293T细胞中，中靶位点的基因渐变几率显明下降。与家养型sgRNA相比，光敏可切割的pcRNA的脱靶/中靶比例升高了2-9000倍。为明晰解其背地的分子机制，作者通过体外切割试验检测了cas9/pcRNA的切割能源学特征。成果标明，在一切承受检测的靶向序列中，pcRNA的初始切割速度相比传统sgRNA显明更慢，但终极的切割速度到达相称的程度。此外，在sgRNA序列与靶向序列存在差别的环境下，传统的sgRNA仍然可能介导高速度的切割，而pcRNA的切割速度显明更慢。这些成果标明pcRNA相比传统sgRNA具备更低的中靶率。

之后，作者研讨了pcRNA-Cas9到达无效切割活性时所需的最低光阴，作者进行了体系的能源学阐发而且绘制了光阴曲线。成果标明，虽然因序列差别存在较高的异质性，但关于AncBEmax而言最低光阴仅需4小时，而Cas9则必要36小时。

7.

doi:10.1038/s41467-021-22295-w

Prime Editor（PE）”是一类新型的基因编纂对象，该技术无需依赖于双链DNA断裂或外源供体DNA模板，即可介导基因组修饰。通过prime editing guide RNA中自身存在的“模板”序列，从而完成准确的单碱基替换或小规模的拔出/缺失渐变。为了探求该对象在成年小鼠中的基因编纂才能，来自麻省年夜学医学院的Wen Xue团队进行了深化研讨。相关成果颁发在比来的《Nature Communications》杂志上。

此前研讨发现，Cas9元件中细胞审定位旌旗灯号（NLS）序列的构成和数目会影响其基因编纂效率，原始的二代PE（PE2）包括两个NLS序列，转染以及细胞定位染色成像成果显示，约60％的卵白质存在于U2OS细胞的细胞核中，约85％的卵白质存在于HeLa细胞的细胞核中。在此根底上，作者在C末尾增加N端c-Myc NLS序列，同时保留SV40 NLS序列，成果显示：改革后的PE2可能完整定位于细胞核内，作者将其定名为PE2*。此外，作者还对PE2*的次要框架进行了改革，使其可能辨认加倍普遍的PAM序列。为了研讨改革后的PE2*可否进步其基因编纂效率。作者比拟了HEK293T mCherry申报体系在别离转染了PE2和PE2 *之后的核苷酸转化比例。转染后3天，作者通过流式细胞术量化PE2以及PE2*的编纂效率。成果显示与PE2（9.2％至16.5％）相比，PE2 *的编纂效率进步了1.5-1.6倍（14.3％至26.4％）。在另外一个类似的申报体系中，PE2*的基因编纂效率比PE2进步了1.6-1.9倍。

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