一双“雪亮的眼睛”能看穿冷冻卵子的活动 拉曼光谱确实“可靠”

来源：生物探索2022-08-26 1:38

卵细胞冷冻保存过程中，除了与水冷冻有关的损伤和冷冻保护剂的毒性外，还会发生与细胞结构材料低温变化有关的损伤。

卵细胞冷冻保存过程中，除了与水冷冻有关的损伤和冷冻保护剂的毒性外，还会发生与细胞结构材料低温变化有关的损伤。细胞的脂质结构，如膜和脂滴，容易被低温破坏。在生理温度下，大多数生物相关脂质处于液体无序相。当冷却到低温时，脂质变成固体有序相。相变改变脂质结构的材料性质，包括刚性和扩散速率。因此，这种转化可能会影响不同细胞器中与脂质相关的生物过程。

当拉曼光谱遇到冻融细胞脂滴时：

脂质相变的原位无标记捕获

细胞膜由不同熔点的磷脂混合物组成。细胞膜的现代模型是基于不同脂质组成的脂质结构假说，具有有序相的高熔点脂质结构形象地称为raft。不同阶段脂质的共存和平衡在细胞功能的调节中起着重要作用。降低温度会改变不同脂质之间的平衡，从而破坏膜的功能。膜特性的变化可能是由于温度的变化，除此之外，也可能是由于水的溶质效应和冰晶的形成，所以膜中的脂质相变(LPT)会影响细胞冻存后的活性。

脂滴是富含脂质的细胞器，在脂质代谢、细胞信号转导和调节中发挥重要作用。LDs的低温变化会影响哺乳动物卵母细胞冷冻保存后的活性。一项实验证明，猪胚胎细胞中的LDs在低温耐受性的研究中发挥了明显的作用，即预先进行了机械脱水的细胞在冷冻保存后的存活率从0%提高到50%以上。与磷脂膜相似，细胞冷冻过程中LD也会发生LPT。与细胞膜类比，可以假设细胞质中的LDs在特定温度下不进行单一熔点的LPT，而是逐渐扩散到不同熔点的脂质中。细胞内LD的LPT可能干扰细胞功能，但LD相关低温损伤的具体机制尚不清楚。至少到目前为止，还没有明确的直接证据表明冷冻细胞中细胞膜与LD之间存在脂质空间分离。

红外光谱是研究生物细胞中脂质相最常用的实验方法，而拉曼光谱是另一种检测脂质相的方法。与红外光谱相比，拉曼散射光谱可以在微观尺度上研究冷冻样品，并以非接触和无标记的方式进行测量。此外，拉曼技术可以抵抗水分子峰值的干扰。先前对卵母细胞和胚胎中单个LD的拉曼研究表明，与甘油三酯和磷脂系统模型相比，拉曼光谱在检测LPT的发生和扩散方面具有相对较高的准确性。相干反斯托克斯拉曼散射研究发现，当白脂肪细胞中的ld在富含脂肪酸的培养基中培养时，会发生脂质相分离，这间接表明LPT会在不同的温度下在不同的脂质中发生。

低温生物学：拉曼光谱用于

研究细胞冻融后的活性是可行的。

2020年8月，俄罗斯科学院自动化与电气研究所团队发表了一项研究成果，题为《低温生物学中家猫冷冻过程中脂质分离的拉曼光谱证据》(图1)[1]。结果表明，在25C的环境下，脂质会以两个独立的相共存，并在几微米的检测空间区域内具有特定的空间分布。其中，高熔点脂质会分布在液滴表面附近，而低熔点/熔点脂质会分布在内部深处。拉曼光谱可以揭示细胞内脂质相变的不均匀性，证明拉曼光谱在研究脂质不均匀性对生物细胞低温保存的影响方面是可行的。

菲古尔

本研究以卵母细胞为研究对象，使用甘油/丙二醇(PG)作为冷冻保护剂，按照标准冷冻方案对卵母细胞进行冷冻保存。具体来说，冷冻方案包括四个步骤：(I)以1/min的降温速率从室温降至-7；(ii)用冷铜线接触样品以形成冰芯；(三)在-7下保持10分钟；(iv)以0.3/分钟的速度进一步冷却至-25。大多数卵母细胞和胚胎在冷冻程序中保持-710分钟形成冰核，这是冰结晶的必要阶段。冷却过程在特定温度下暂停，用于拉曼检测。

拉曼采集平台采用固体激光器(激光波长532.1 nm)，100物镜(NA=0.75)，水平分辨率~0.6 m，垂直分辨率~10 m，光谱分辨率2.5cm-1；以扫描模式测量一组拉曼光谱，并在指定坐标处检测拉曼散射。光谱探测范围1000 ~ 3200cm-1，曝光时间3s。在单次拉曼成像实验中测量了大约2500个光谱。初步数据处理包括测量光谱中高能离子的宇宙线去除、基线校正等。进一步的多变量分析包括数据处理方法，例如使用交替最小二乘算法的拉曼光谱的奇异值分解和非负矩阵分解。

结果表明：

1.不同温度下脂滴的拉曼光谱特征。

具有一定规律性

如图2所示，在不同的冷冻温度下收集卵母细胞的拉曼光谱，并分析对脂质相变敏感的aCH2键在拉曼频移2882 cm-1处的特征表达，其峰值用来表达不同温度下的脂质相态；通过在~2850 cm-1处具有强烈拉伸对称CH2(sCH2)峰，可以在拉曼图中识别出富含脂质的物质。经过，在不同温度下脂滴的光谱特征具有一定规律，不同温度时光谱峰值均数：n=1666@-25℃；n＝1214@-15℃；n＝636@-3℃；n=478@+5℃；n=638@+15℃；在-3℃及以下测量的拉曼光谱（图2b）表明拉伸反对称CH2(aCH2)峰对LPT敏感。以上统计的数据表明，LPT开始发生的温度是在+5和-3℃之间。

注：（a）不同温度下（-25℃~+15℃），卵母细胞中脂滴对应的平均拉曼光谱；CH谱带的拉曼特征区域；（b）表示键在2882处的特征峰。虚线是统计基线。

低温下卵母细胞以及胚胎中，aCH2峰的强度大约是sCH2峰强度的0.7倍。该峰的强度低可能有两种不同的情况导致，第一种可能的情况是所有脂质分子都处于大致相同的构相状态，随着温度的降低逐渐变为更有序的构相状态，这种情况对应于均匀的扩散相变；第二种情况涉及脂质分子以有序和无序的相态共存，在这种情况下，处于无序相态的脂质比例会随着温度升高而降低。

2、拉曼光谱用于检测冷冻卵细胞中脂质相分布不均匀性

为了证实LD中是否存在脂质相态共存，研究人员使用PG作为冷冻保护剂，在T=-25℃条件下处理10分钟后进行两个拉曼成像实验：第一个实验是在-25℃下初步暴露两小时后使用甘油作为冷冻保护剂进行的；第二个实验用于揭示在其他条件下是否会观察到相态共存效应。

研究人员使用NMF-ALS方法构建拉曼谱图，在三个光谱分量的线性组合上分解所有拉曼光谱：这些光谱分量对应于有序相态脂质（SOL）、无序相态脂质（SDL）和细胞质（SC）的贡献。对应的SOL在2882 сm-1处有一个CH2峰，sCH模式下的拉曼位移置为2845 cm-1；SDL无aCH2的显著峰，2849 сm-1处有CH2峰；SC为冷冻保护剂（甘油或PG，取决于实验条件）和细胞质蛋白的水性混合物。

图3显示了在-25℃甘油溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（3a）和拉曼成像图（3b）。明场显微镜观察仍然无法判断脂质空间分布的不均匀性（图3a），但拉曼成像图谱可以看出不同相态的脂质在微米尺度上分布不均匀（图3b）。根据图3c中脂质光谱1和2的比较，aCH2拉曼峰（IaCH）的信噪比估值大于10。因此，拉曼光谱1和2之间的IaCH差异是显著的。

注：（a）卵母细胞内明场显微镜图像；（b）有序（青色）和无序（红色）状态下脂质的拉曼图谱；（c）（b）图拉曼成像中不同代表点处的拉曼光谱，1-有序脂滴区；2-无序脂滴区；3-细胞质。（d）C-H键拉伸区域对应光谱，1-有序脂质、2-无序脂质、3-细胞质。

图4显示了在-25℃丙二醇溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（4a）和拉曼图（4b和4c）。SC的差异与甘油和PG的拉曼光谱不同有关，因为甘油拉伸CH带的拉曼光谱在2890、2945 сm-1处仅包含两个明显峰，而PG光谱中在2885、2940、2980 сm-1处有三个峰。值得注意的是，在第二个实验中的平均脂质有序度更高，达到0.31，这种差异是违反常识的，因为长时间暴露于低温有助于相变达到更稳定状态，因此，第一个实验应该具有更高的脂质有序度，而这种脂质有序度偏差的原因可能是实验中卵母细胞的来源不同，或者测量中使用的两个卵母细胞是在不同时间、不同的猫获得的，因此可能具有不同的脂质含量；另一个原因可能来自NMF-ALS方法的系统误差，可以注意到，光谱分量SOL和SDL在图3和图4中也有所不同。

注：（a）冷冻卵母细胞的明场显微镜图像，矩形为用拉曼光谱研究的区域；(b)有序（IOL青色）和无序（IDL，红色）状态下的脂质拉曼图；(c) 的空间分布；(d)多变量分析得出的拉伸CH区域中的光谱成分（SOL 有序脂质，SDL 无序脂质，SC 细胞质）；(e)脂质有序度 分布直方图。

3、拉曼光谱用以监测冷冻卵母细胞内脂质相状态变化

为评估脂质相状态的变化，研究中定义了脂质有序度： =IOL/（IDL+IOL)。对所有光谱中脂质强度超过最大值的20%（图5）进行统计。图中脂质有序度分布广泛，可以使用正态分布来描述，其平均值 =0.18，这种分布的单峰性表明脂质处于有序和无序状态的区域逐渐分离（图5a）。图5b所示的 的空间分布证明了从0到0.4不等的具有不同脂质有序度的脂质共存， 的中间值可能由于深度分辨率不足以检测隐藏在某类脂质有序度脂质后的其它有序度脂质。

4、 指纹区 拉曼光谱成像揭示脂滴内部不饱和脂质分布

通过测量1000-2000 cm-1的 指纹 光谱区域，虽然脂质在该区域的拉曼光谱特征峰比CH拉伸带的峰强度低了约4倍，但是该指纹区域却包含了更多物质的拉曼谱带可以提供其它化学成分的有效信息。

研究发现，有序相状态的脂质会分布在LD的边界上，并形成环状结构，而无序状态的脂质主要位于LD的内核中。在图6a（见标记区域）中，可以识别出至少10个具有环状结构的LD。研究以1660cm-1位置处的不饱和脂质中C=C键和1745cm-1的C=O键比值表示不饱和脂质度的空间分布，由图6中的可视化结果显示，其平均IC=C/IC=O比率为6.05，对应于每个烃链约1.2个双键（图6b）。拉曼光谱对三个组分的分解并表征有序脂质、无序脂质和细胞质蛋白与冷冻保护剂混合物的贡献（图6c）。IC=C/IC=O比率从5（每条链约1个双键）到6.8（每条链约1.35个双键）（图6d），分析结果与实际预估一致。

此项研究使用显微拉曼光谱成像技术来揭示了冷冻过程中卵母细胞内LD的脂质相分离现象。并使用甘油和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻实验，实验结果证实脂质在LD内按照不同脂质不饱和度进行分布，研究数据还表明，饱和脂质可能在LD表面发生LPT，而不饱和脂质是在LD核心处保持着无序的液相状态。

在许多哺乳动物中，LD会影响细胞活性，细胞内脂质的增加量是胚胎冷冻保存成功的主要限制。尽管几十年来已经研究了高脂质含量的卵母细胞和植入前胚胎的冷冻保存问题，但富含脂质的卵母细胞和胚胎的冷冻损伤研究仍然很少。在温度升高到LPT开始以后的脂质重新分布对细胞的作用仍不清楚。在有序相熔化后，LD内的大多数脂质很有可能都混合到均匀的混合物中。然而，冷冻后混合脂质所需的时间是未知的，需要更多的研究来揭示脂质再分布的不同方面及其对冷冻保存后细胞存活和发育的影响。脂质再分配的作用可以在细胞解冻后立即在细胞存活和脂质代谢中发挥重要作用。拉曼光谱似乎是研究生物细胞中LPT的一种前瞻性方法，可提供有关微米级脂质分布的信息。此项研究证明拉曼为研究与LD相关的低温损伤机制以及制定减轻这些损伤的策略开辟了新的可能性。

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