《自然·免疫学》:刷新认知！干扰素

来源：奇点蛋糕2022-11-22 1:20

这项研究发现，在许多动物模型中，IFN敏感性的丧失使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制来调节。首先，经典MHC-I分子的上调可以抑制NK细胞，其次，非经典MHC-I分子Qa-1b的上调可以实现。

检测点阻断(ICB)疗法在多种肿瘤中取得了巨大成功。然而，仍有许多患者对ICB没有反应，不同肿瘤中的免疫逃逸机制有待进一步探索。

近日，布罗德研究所的罗伯特t曼古索(Robert T. Manguso)和凯瑟琳b耶茨(Kathleen B. Yates)领导的研究团队在著名期刊《自然免疫学》(Nature Immunology)上发表了重要研究成果[1]。

为了发现肿瘤逃避免疫治疗的机制，他们在用ICB治疗的癌症模型中进行了基因组水平的CRISPR筛选。

他们的发现令他们惊讶：在许多肿瘤模型中，肿瘤细胞对干扰素(IFN)敏感性的丧失甚至使肿瘤对ICB更加敏感。

具体来说，肿瘤IFN信号通过两种方式发挥免疫抑制作用：一是肿瘤IFN诱导可以上调经典的MHC-I主要组织相容性复合体(MHC-I)，抑制自然杀伤(NK)细胞；其次，肿瘤IFN诱导通过上调非经典MHC-I分子Qa-1b抑制CD8 T细胞。

要知道，大量研究表明，IFN-在肿瘤免疫监视中发挥着重要作用[2-4]。这个发现可以说颠覆了我们对IFN- signal的认知。

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接下来，我们来看看这个研究是如何进行的。

研究小组使用代表五种癌症类型(黑色素瘤、肾癌和)的八种小鼠肿瘤模型进行CRISPR体内筛选，找出ICB治疗后富集或清除的sgRNA，从而识别与ICB耐药或敏感相关的基因(基因缺失时分别与ICB耐药或敏感相关)。

他们发现Nlrc5、Pten、Casp8、Ccar1、Ubr5、Dot1lh、Smg9和Pdcd10的缺失与ICB耐药有关，并在体内验证了新发现的Ccar1缺失的ICB耐药机制。

在ICB敏感性方面，除了已报道的Ptpn2、Traf2、Ripk1、Serpinb9、Cd47、Atg7外，研究小组还发现Calr、Rnf31、Vps45、Ilf2、Pnpo、Kcmf1、Fitm2、Morc2a和Thop1的缺失与ICB敏感性有关，并进一步与Calr、Med16和RNF30有关。

通过CRISPR筛选发现与ICB抗性或敏感性相关的基因

研究小组进一步对消除的sgRNA进行了途径富集分析。令人惊讶的是，与MHC-I抗原呈递信号通路相关的基因在除Lewis肺癌细胞(LLC)之外的所有模型中均被消除，并且与细胞因子反应、II型IFN和先天免疫相关的基因也在许多模型中被消除。这表明这些基因的缺失会使肿瘤细胞对ICB更加敏感。

众所周知，IFN-可以上调MHC-I分子的表达，从而促进细胞毒性CD8 T细胞(CTL)识别肿瘤细胞[4]。许多研究表明，干扰素敏感性的丧失与ICB的耐药性有关[2，3，5，6]。在类似的小鼠肿瘤模型中进行体外CRISPR筛选，发现肿瘤细胞中IFN和抗原提呈途径的缺失会导致肿瘤细胞抵抗CTL杀伤[7]。然而，这项研究发现抗原呈递和IFN途径相关基因的清除实际上与ICB的敏感性有关，这似乎与上述研究结果相矛盾。

为了找出矛盾背后的原因，曼古索团队进一步将他们的体内CRISPR筛选结果与之前的体外CRISPR筛选结果进行了比较。结果发现了一些与IFN相关的基因(如Jak1、Ifngr1、Ifngr2)和抗原提呈相关的基因(如Tap1、Tap2、B2m)，分别在体外和体内CRISPR模型中得到富集和清除。

这一发现表明，这些基因的缺失可能会促进肿瘤细胞对体外T细胞杀伤的抗性。在体内研究中，这些基因的缺失使得肿瘤细胞对T细胞更加敏感。

体外模型和体内模型CRISPR筛选sgRNA的比较

为了进一步探索干扰素诱导肿瘤细胞产生ICB耐药性的机制，Manguso

团队对比了ICB治疗后的清除的sgRNA与IFN- 刺激后改变的IFN刺激基因（ISG）。结果显示，抗原呈递相关基因（H2-T23、B2m、Tap1、Tap2、Tapbp和Erap1）在ISG中富集，这些基因同样在ICB治疗后清除的sgRNA中富集，这提示这些基因能够被IFN- 刺激诱导上调，并与ICB治疗的抵抗性相关。

体外实验也说明，在IFN- 或IFN- 刺激后，经典MHC-I类分子H-2K、H-2D，非经典MHC-I类分子Qa-1b以及PD-L1的表达会发生上调。这些结果提示IFN诱导的ICB抵抗机制可能是由MHC-I类分子的上调所介导的。

IFN- 刺激能够诱导多种发挥ICB抵抗性的基因上调

为了验证这一假设，研究团队设计了一种体内竞争性实验，以检测IFN- 感应基因和MHC-I类抗原呈递途径相关基因的遗传上位性。

他们将对照sgRNA和靶向Ifngr1或Jak1（IFN- 感应基因）的sgRNA转染的KPC细胞（这些细胞分别是对照sgRNA背景、Tap1敲除背景和B2m敲除背景，Tap1和B2m为MHC-I类抗原呈递途径相关基因）1：1混合，然后将这些细胞分别在NSG鼠，WT鼠和接受ICB治疗的WT鼠体内成瘤，对比不同组中转染对应sgRNA的细胞的富集与清除。

结果显示，在对照sgRNA背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞被清除；而在Tap1和B2m敲除背景的细胞中，Ifngr1或Jak1敲除的细胞没有发生显著清除。这提示相比于对照细胞，IFN感应性缺陷的细胞具有依赖于MHC-I类的竞争劣势，即IFN感应性通路发挥功能依赖于MHC-I类分子的表达。

IFN- 感应基因发挥功能依赖于MHC-I类抗原呈递途径相关基因

在人类基因组中，6p21.3基因座编码MHC-I类分子表达相关的基因，如TAP1、TAP2、TAPBP、PSMB8和PSMB9等[8-10]。TCGA中多种癌种都有超过10%的肿瘤发生了6p21.3缺失，然而6p21.3缺失与绝大多数肿瘤患者的生存无关。

在接受抗PD-1治疗的肾透明细胞癌患者队列中，当肿瘤为6p21.3两倍性时，高ISG特征与患者更差的生存相关。然而在6p21.3缺失的肿瘤中，高ISG特征不再与患者更差的生存相关。这提示肾透明细胞癌中，IFN介导的ICB抵抗作用依赖MHC-I类分子。

肾透明细胞癌中高ISG特征仅在6p21.3两倍性肿瘤中与患者差的预后相关

研究团队为进一步鉴定体内杀伤IFN感应性缺陷肿瘤的免疫细胞，分别在ICB治疗时使用抗体清除CD8+T细胞、NK细胞和CD4+T细胞，结果显示NK细胞和CD4+T细胞的清除影响了对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤，而清除CD8+T细胞对Jak1缺陷肿瘤细胞的杀伤没有影响。由于NK细胞不表达PD-1，而CD4+T细胞表达PD-1，研究团队推测ICB治疗后，CD4+T细胞辅助NK细胞发挥肿瘤细胞杀伤作用。

为进一步在体外验证NK细胞对IFN感应性缺陷肿瘤的杀伤能力，他们将Jak1缺陷和对照肿瘤细胞，分别与IL-12/18激活的NK细胞共培养，结果显示活化的NK细胞能够杀伤Jak1缺陷肿瘤细胞，而肿瘤细胞中Tap1或H2-K1的缺失可以逆转这一效应。这提示肿瘤IFN感应性可以通过上调经典的MHC-I类分子，在体内和体外抑制NK细胞的毒性。

Manguso团队进一步探究了哪些MHC-I类抗原呈递途径的基因发挥功能依赖于NK细胞，他们对比了NK细胞清除与不清除时，ICB治疗清除的sgRNA。结果显示，尽管Ifngr1、Ifngr2、Stat1、Jak1、Jak2和H2-K1的清除表现出NK细胞依赖性，靶向Tap1、Tap2、H2-D1和H2-T23这几个抗原呈递基因的sgRNA在NK细胞存在与不存在时都会发生清除。这说明部分MHC-I类抗原呈递分子的缺失，所引起的肿瘤细胞杀伤是非NK细胞依赖性的。

在上述基因中，H2-T23引起了Manguso团队的关注。因为H2-T23编码非经典MHC-I类分子Qa-1b（相当于人类中的人类白细胞抗原HLA-E），而Qa-1b能够结合抑制性受体NKG2A/CD94。这些结果提示尽管NK细胞介导了对IFN感应性丧失的细胞的杀伤，但是某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制其他的效应性细胞群。

某些MHC-I类分子（如Qa-1b）的表达可能会抑制除NK细胞外的效应性细胞

为了探究Qa-1b表达抑制了哪些效应性细胞群，研究团队首先检测了Qa-1b的缺失是否会增强ICB响应。结果显示，Qa-1b的缺失会增强ICB响应，而Qa-1b的过表达能抑制ICB响应。

当在接受ICB治疗的小鼠胰腺导管腺癌（KPC）肿瘤模型中敲除HT-T23后，分别清除NK细胞和CD8+T细胞，结果显示NK细胞清除对于Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应没有影响，而CD8+T细胞清除抑制了Qa-1b缺陷型肿瘤的ICB响应。这提示Qa-1b主要通过抑制CD8+T细胞发挥作用。

单细胞测序数据也提示，ICB治疗后引起效应、耗竭和增殖的CD8+T细胞亚群扩增。而效应、耗竭和增殖CD8+T细胞亚群高表达NKG2A（Klrc1）和CD94（Klrd1），这提示肿瘤细胞的Qa-1b表达可能通过与CD8+T细胞的NKG2A/CD94抑制性受体结合发挥作用。

ICB治疗时CD8+T细胞发挥杀伤Qa-1b缺陷肿瘤作用

由于IFN能够诱导Qa-1b的表达，Manguso团队假设肿瘤的IFN感应性可以通过Qa-1b抑制CD8+T细胞。然而由于肿瘤IFN感应性丧失可能引起经典的MHC-I类分子下调，导致对CD8+T细胞的抗性，从而掩盖IFN可能介导的抑制作用。为解决这个问题，利用嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行杀伤试验，由于细胞的识别不依赖于MHC-I类分子，可以避免IFN- 处理后MHC-I类分子上调带来的影响。

他们首先检测了CD19 CAR-T细胞对Qa-1b缺陷型CD19+KPC细胞的杀伤能力，结果显示CD19 CAR-T显著杀伤Qa-1b缺陷型肿瘤细胞，提示Qa-1b能够抑制CAR-T的杀伤能力。

为探讨Qa-1b上调是否是由IFN介导的CAR-T细胞杀伤抵抗机制，Manguso团队将CD19 CAR-T细胞分别与IFN 刺激的对照和Jak1（IFN- 感应基因）敲除CD19+KPC细胞的混合物1:1共培养。结果显示，CAR-T细胞对于这2类细胞的杀伤能力没有显著差异，这表示CAR-T细胞消除了Jak1敲除肿瘤细胞的生存优势。

为了探究IFN诱导的PD-L1上调是否抑制CAR-T的杀伤能力，他们检测了CAR-T联合抗PD-1单抗时两组细胞的存活情况。结果显示当CAR-T联合抗PD-1单抗时，Jak1敲除肿瘤细胞存活增多，这提示PD-L1上调对T细胞杀伤能力发挥抑制作用，联用抗PD-1单抗能够杀伤更多对照组肿瘤。

当Manguso团队使用Qa-1b缺陷型KPC细胞或联用抗NKG2A抗体时，结果显示Jak1敲除肿瘤细胞存活显著增多。这些结果提示CD8+T细胞优先杀死具有完整IFN感应能力的肿瘤细胞，而Qa-1b的上调抑制这种杀伤能力。至于背后的机制，Manguso团队认为这可能是因为IFN能够诱导粘附分子（如ICAM-1）的表达[11]，进而促进CD8+T细胞的杀伤。

在体内实验模型中，Manguso团队发现CAR-T对Jak1缺陷型肿瘤杀伤作用明显，而这种杀伤能力在Qa-1b缺陷的肿瘤中消失。这些结果提示IFN信号可以通过上调Qa-1b来抑制CAR-T细胞毒性。

IFN信号通过上调 Qa-1b来抑制 CAR-T 细胞毒性

最后，Manguso团队探讨了IFN信号对于免疫治疗响应预测的能力。

他们分析了一组接受抗PD-1单抗治疗的黑色素瘤患者队列（6p21.3两倍性），发现ISG的表达与更好的响应相关，这一结果与前述的ccRCC患者队列中的结果相反。

这提示利用IFN特征预测ICB响应需要考虑CD8+T细胞和NK细胞的响应优势，在NK细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗差的响应相关；而在CD8+T细胞响应占优时，IFN特征与接受抗PD-1治疗好的响应相关。

高IFN特征在不同肿瘤微环境中与不同的ICB响应相关

Manguso团队还评估了1个接受ICB治疗的202名黑色素瘤患者的队列，分别在基线、治疗后6周和治疗后6个月时间点取样，检测血清中ISG蛋白的水平。

结果显示，在治疗后6周时，响应和无响应患者血清ISG蛋白含量都会增加。而治疗后6个月时，无响应患者血清ISG蛋白含量显著增加。并且，在这2个时间点，血清ISG的变化都与患者更差的无进展生存相关。因此，接受ICB治疗过程中，对于ICB的抵抗可能与IFN和ISG的水平升高有关。

ICB治疗后血清ISG蛋白水平升高与治疗抵抗有关

总的来说，这项研究发现了IFN感应性的丧失在多个动物模型中使得肿瘤对ICB更加敏感。这可以通过两种机制介导，第一是经典MHC-I类分子的上调能够抑制NK细胞，第二是非经典MHC-I类分子Qa-1b的上调可以通过NKG2A/CD94抑制CD8+T细胞。

既往研究往往关注IFN感应性的丧失会引起对ICB的抵抗，这项研究提示了IFN感应性功能的复杂性，IFN介导的MHC-I类分子上调可以发挥促进对CD8+T细胞抗原呈递和抑制NK细胞的双重作用。在高表达NK配体（MICA和MICB）的肿瘤中，由于IFN驱动的MHC-I类分子上调可以抑制NK细胞，高ISG特征与差的响应相关。而在T细胞高度克隆扩增的肿瘤中，由于IFN能够促进对T细胞的抗原呈递，高ISG特征与好的响应相关。因此，ISG特征在肿瘤中的作用可能取决于肿瘤中的免疫效应主要由NK细胞还是CD8+T细胞介导。

除此之外，这项研究中发现非经典MHC-I类分子Qa-1b（HLA-E）可以发挥免疫抑制作用，非经典MHC-I类分子如HLA-F、HLA-G可能发挥的免疫抑制作用也值得进一步探索。

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