Cell：刘如谦团队进化出更高效、更紧凑的先导编辑器，为治疗应用扫除障碍

来源：生物世界 2023-09-04 11:57

刘如谦教授表示，一项技术是否有用的真正试金石是人们最终是否采用它，很期待看到PE6如何应用于PE编辑领域。

刘如谦团队在Cell期刊发表了题为：Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors的研究论文，对先导编辑（PE）系统进行了优化和改进，使其进化成更高效的基因编辑工具。

该研究通过噬菌体辅助进化（PACE）技术和蛋白质工程开发了先导编辑（PE）系统的改进版本。新的PE系统拥有更高的基因编辑效率，能够编辑此前难以编辑的细胞和动物器官中的DNA 包括细胞和活体小鼠的大脑。此外，该系统所具有的更小、更紧凑的蛋白结构也使其更容易递送。

先导编辑（PE）系统系统由多种分子机器组合而成：一种部分失活的Cas9切口酶（Cas9 nickase，nCas9），它可以产生DNA单链切口；一种工程化的PE向导RNA（pegRNA），它既指定了编辑的位置，也包含了替换该位点的新遗传指令；以及一种逆转录酶的工程版本，它使用RNA作为模板对DNA进行特定的改变。

先导编辑系统由两部分组成：一个含有DNA切口酶（Cas9 nickase，nCas9）和工程逆转录酶（RT）的融合蛋白；另一个是PE向导RNA pegRNA。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔体（spacer），一个单向导RNA（sgRNA）支架和一个编码所需编辑的3 端扩展。

该3 端扩展包含一个引物结合位点（PBS），它是互补的一部分DNA原间隔和一个RT模板，编码所需的编辑和下游基因组序列。PE系统与靶位点结合后，将含有PAM序列的DNA链切出，切出的DNA链碱基对与pegRNA中的PBS结合，从而将反转录的编辑序列直接引到靶DNA位点。新合成的编辑DNA的3 端随后通过细胞DNA修复途径分解，最终在目标位置进行所需的编辑。

先导编辑系统工作示意图

PE系统有望纠正大多数导致疾病的基因突变，但其效率可能因编辑的位置和类型以及被编辑的细胞类型而有很大差异。在某些情况下，只有百分之几的细胞能够倍成功编辑。

为了提高PE系统的编辑效率，刘如谦团队一直致力于不断优化和改进PE系统的每个部分。此前，研究团队已经优化了pegRNA和细胞对PE编辑的反应方式。在这项最新研究中，他们专注于改进PE系统的核心 逆转录酶。

PACE进化获得逆转录酶变体

在自然界中，逆转录酶广泛存在于所有植物和动物细胞以及许多病毒中，它可以依照RNA模板合成与之互补的DNA链。然而，天然的逆转录酶通常导致较差的PE编辑效率，因此，PE系统通常采用人工改造的工程逆转录酶。

为了更有针对性地优化PE编辑器的逆转录酶结构域，刘如谦团队转向噬菌体辅助进化（PACE）技术，这是刘如谦团队在2011年开发的一种蛋白质定向进化方法。

简单来说，PACE技术模拟了物竞天择的自然进化筛选过程：首先需要培养多种快速进化的噬菌体，同时对其进行不断稀释，而只有那些表达具有特定理想特征的蛋白变体的噬菌体才能通过比稀释速度更快的复制速度存活下来。

开发和验证PE编辑器的PACE选择

在这项新工作中，研究团队开发了一种PACE系统，该系统可以对有缺陷的噬菌体基因进行PE编辑，从而对噬菌体进行达尔文选择。在数百小时的时间里，携带原始PE编辑器的噬菌体经历了数千代的进化，迅速产生具有全新结构的逆转录酶。

刘如谦团队由此产生了一套新的PE编辑器 从PE6a到PE6g，每个系统都包含一个新的逆转录酶或Cas9变体。研究团队用不同类型的基因编辑任务测试了这些新的PE编辑器，他们发现，PE6a到PE6g具有不同的编辑偏好，它们仅在某一类基因编辑任务（例如插入短DNA片段）中提高了编辑效率，但其他情况下表现不佳。

新型PE编辑器 从PE6a到PE6g

这一发现推翻了此前认为的一种PE编辑器可以同时胜任多种基因编辑任务的假设。通过PACE技术获得的新型PE编辑器出现了功能特化，就像游戏里的战士、法师、刺客和射手等不同职业一样，专门从事不同的编辑任务。

迈向治疗

基于上述实验结果，研究团队测试了新型PE编辑器（PE6a PE6g）在不同基因编辑任务中的表现，并以此揭示了一套规则，规定了这7种先导编辑器中的每一种应该在什么时候使用，然后做了更多的实验来证明它们的实用性。

例如，一些PE6变体可以在人类细胞系基因组的五个不同位置插入更长的DNA片段，长度从38到108个碱基对不等，与目前的PE编辑器相比，其编辑效率更高。此外，这些PE6变体还扩展了PE编辑的范围，在此前难以编辑的细胞类型或器官组织中表现出更高的编辑效率，例如免疫细胞和活体小鼠的大脑。

PE6变体能够在体内进行更长的、更复杂的PE编辑

通过双AAV载体递送新型PE编辑器，研究团队能够将一长段DNA序列插入小鼠大脑皮层40%的细胞中，这比之前最先进的PE编辑系统提高了24倍！从不到2%的编辑效率发展为如今40%的编辑效率，这种巨大的差异足以支持这些新型PE编辑器在治疗应用中的发展。

除此之外，新型PE编辑器的分子量更小，在结构上也比以前的版本更紧凑，从而允许整个PE编辑平台适应以前PE编辑器难以适应的递送系统。这类紧凑版的PE编辑器可能更容易用于动物模型，最终用于人类患者。

研究模式图

刘如谦教授表示，一项技术是否有用的真正试金石是人们最终是否采用它，很期待看到PE6如何应用于PE编辑领域。

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