研究揭示体外组装和体内染色质纤维普遍存在的双螺旋折叠模式

《细胞报告》（Cell Reports）在线发表了中国科学院生物物理研究所朱平研究组撰写的题为Cryo-ET study from in vitro to in vivo revealed a general folding mode of chromatin with two-start helical architecture的研究论文。该研究通过冷冻电子断层三维成像方法（Cryo-Electron Tomography，Cryo-ET），分别探究了体外组装的长染色质纤维，在HeLa细胞中提取的染色质纤维以及蛙血红细胞核内的原位染色质纤维结构。研究发现，这些由连接组蛋白介导形成的染色质纤维具有一种普遍存在的双螺旋two-start zigzag结构。结果表明，体外组装的染色质、从细胞核内提取的染色质纤维以及体内的原位染色质，局部均遵循一种统一的双螺旋ZigZag折叠模式（图1）。虽然各种复杂环境等因素会造成染色质组成成分及相互作用的不均一性，并由此使得染色质整体结构的复杂多变，但染色质纤维局部核小体排列仍满足一种普遍的two-start zigzag折叠模式。

在高等生物个体的发育和分化过程中，生命体通过各种表观遗传调控染色质高级结构的动态变化，调控基因的开放、关闭和转录水平，从而决定细胞的组织特异性和细胞命运。因此，染色质的高级结构、动态变化及调控机制对认识生命过程的本质具有重要意义，是现代分子生物学的基本问题。既往研究利用冷冻电镜单颗粒分析方法（Cryo-EM SPA），对体外组装、由12个核小体重复长度（NRL）为177 bp或187 bp的均一核小体组成的染色质纤维颗粒（12x177 bp，12x187 bp）进行三维结构重构，发现了具有一种特殊的双螺旋two-start zigzag结构，为认识染色质高级结构和折叠的分子机制提供了重要信息。

然而，细胞核内高度密集的染色质情况复杂，染色质折叠和高级结构形成过程受各种不同表观调控因子影响，使得体内染色质原位结构研究较为困难，染色质原位结构及组成存在较大争议。例如，体外组装的染色质纤维，结构是否随着纤维长度（核小体个数），核小体之间连接DNA长度（或核小体重复长度NRL）以及各种表观遗传修饰的变化而改变？此外，与体外组装染色质所处的相对简单和均一的环境不同，细胞核内染色质的复杂成分和环境条件对染色质折叠有多大影响？体外和体内染色质是否具有一种普遍适用的折叠模式？针对上述问题，该研究比较了体外组装、细胞提取以及细胞核内三种染色质纤维的结构。

该研究利用冷冻电子断层三维成像方法解析了体外组装的由50个核小体组成的长染色质，发现了核小体重复长度NRL长度为200 bp（50x200 bp）的长染色质纤维结构。结果显示，染色质长度以及NRL的增加增强了纤维的柔性。而染色质在短程的范围内仍具有较为均一的亚结构单元。局部亚单位平均（sub-tomogram averaging，STA）结果显示，该亚单元具有two-start zigzag的结构。

科研人员在对从HeLa细胞核内提取的染色质纤维结构解析中发现，由于细胞内DNA序列以及NRL的随机性较强，以及组蛋白与DNA的各种表观遗传修饰具有多样性与随机性，因此提取的染色质纤维的结构具有较强的异质性。该工作分析了核小体之间的距离、角度以及纤维扭曲程度等参数发现，这种异质性染色质纤维中的均一结构比例比体外组装的均质染色质纤维低很多。针对这种难以用STA方法平均的结构，该研究利用空间密度分割的方法直接定位了各个核小体的三维空间位向。结果显示，提取的染色质纤维中核小体排列均满足类似的two-start zigzag规律。

该研究结合冷冻聚焦离子束超薄切片（cryo-FIB）和冷冻电子断层三维成像（cryo-ET）方法，对细胞核内的染色质进行原位结构研究。研究发现，在生理条件下，蛙血红细胞核内存在着大量的染色质纤维。科研人员通过对局部核小体排列规律的观测发现，这些纤维中局部存在短程较为均一的类似two-start亚单元结构。STA平均结果显示，该亚单元的整体扭转较小，核小体表现为相对较为平行的梯状结构，但仍符合two-start zigzag的排列规律。该工作通过冷冻电子断层三维成像结合亚单元结构平均（STA）和电压相位板（VPP）衬度增强等方法，在蛙血红细胞核内观察到染色质纤维内相邻核小体（如N、N+1、N+2核小体）之间连接DNA的清晰zigzag轨迹。

该研究比较了以上体外、体内的不同染色质纤维结构，统计分析了空间密度分割（segmentation）和染色质纤维中核小体之间距离、角度等参数发现，染色质中核小体重复长度（NRL）的变化以及染色质成分组成的异质性（heterogeneous compositions）等主要影响局部核小体的空间构象，但不会改变two-start zigzag结构的折叠方式。由此，该工作提出了一种由连接组蛋白介导形成的染色质纤维普遍的two-start zigzag结构和折叠模式。在此模式中，如果核小体的组成均一，则染色质纤维的结构规律性较强；如果核小体的组成或性质不均一，则纤维的整体结构更不规则。然而，短程距离上核小体排列仍满足two-start zigzag的规律，在局部会存在结构相对均一的亚结构单元。该成果对认识染色质的高级结构组成和折叠形式具有重要意义。

图1. 体外、体内染色质纤维一种普遍存在的双螺旋zigzag折叠模式