Nature Methods

该研究围绕优化低温电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）样本制备过程中的电喷雾（Electrospray, ESI）参数，以减少样本制备时界面效应对蛋白质结构完整性的负面影响。研究通过调节样本流速、喷雾电压、蛋白质浓度及喷射距离等参数，探索其对样本结构保持的影响。利用结构保持良好的蛋白质模型，如APO-铁蛋白（apo-ferritin）和血管紧张素转换酶2（ACE2），进行实验验证，确保获得的数据具有普遍性和可重复性。

样本准备

研究使用纯化的APO-铁蛋白和ACE2作为测试蛋白。这些蛋白先通过常规方法纯化，然后稀释到不同浓度，准备用于电喷雾。

电喷雾参数优化

样本流速：研究中测试了从几微升到几十微升每分钟的不同流速，观察不同流速对蛋白质样本的影响。

喷雾电压：调节电压从几千伏到几十千伏，分析电压变化如何影响蛋白质的电荷状态和结构完整性。

蛋白质浓度：蛋白质浓度的变化直接影响样本在电喷雾过程中的聚集和分散行为。

喷射距离：即样本从电喷嘴到载物玻片的距离，调整此参数以优化样本着陆前的蒸发和冷却过程。

结构分析

采用低温电子显微技术对处理后的样本进行成像，收集数据，并使用图像处理软件如ChimeraX和PHENIX进行三维结构重建和分析。

数据与分析

对实验中获得的大量图像数据进行统计分析，评估不同参数下样本的结构完整性比例。使用负染色电镜（negative staining EM）和native MS对样本的保持情况进行评价。

通过详细的参数调整，研究显示低流速、低电压和高蛋白质浓度条件下，样本的结构保持得最好。这些条件有助于减少蛋白质在空气-液体界面的损伤，从而保持其在冷冻环境下的原始三维结构。此外，低导电性金属材料的使用在纳米电喷雾（nano-ESI）技术中也显示了显著的结构保护效果。