Cell Stem Cell：吴军团队揭示细胞粘附是阻碍异种嵌合体形成的壁垒

细胞粘附不兼容性是影响组织和器官发育的另一种异种屏障【4】。如果供体人类PSCs（hPSCs）无法与小鼠囊胚细胞形成有效连接，它们就会被挤出发育中的胚胎，无法参与后续的发育过程。因此，细胞粘附分子（CAMs）的不兼容性是阻碍hPSCs与宿主外胚层细胞整合并影响种间嵌合体形成的障碍。

细胞粘附阻碍种间嵌合体的形成

在体外培养小鼠囊胚并注射人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验中，研究人员发现人类细胞通常会在注射后的前三天内死亡，这可能是由于细胞竞争所致。存活的hiPSCs主要集中在胚胎的外周区域，而非外胚层。通过使用紧密连接（ZO1）和粘附连接（E-cadherin）标记进行染色，研究发现同种细胞间的连接明显多于异种细胞间的连接。光电显微镜（CLEM）观察显示，不同物种细胞间的膜接触非常有限。此外，流式分析表明，异种细胞之间的粘附性较差，这种现象在活化 (primed) PSCs中更为显著。3D共聚集实验和洗脱实验进一步验证了这一现象，结果显示，同种或密切相关物种之间的细胞混合良好，而进化距离较远物种的PSCs则倾向于相互分离。

纳米抗体克服种间细胞粘附障碍

异种细胞粘附不兼容可能与CAMs的结构和表达差异有关。由于CAMs在发育过程中的动态变化，修改hPSCs中的CAMs以匹配宿主物种的CAMs较为困难。因此，研究人员采用了合成生物学的方法，通过膜结合纳米抗体-抗原相互作用来增强细胞粘附。他们在小鼠胚胎干细胞（mESCs）、人类胚胎干细胞（hESCs）和HFF-hiPSCs上表达了vhhGFP4抗GFP纳米抗体，并通过GPI锚定或CD8跨膜结构将其固定在细胞膜上。

实验结果显示，表达纳米抗体的hPSCs在GFP-GPI mEpiSCs上的粘附显著高于野生型hPSCs，其粘附水平达到与同种细胞相当的水平。然而，纳米-CD8 hPSCs虽然提高了细胞间的粘附性，但也导致细胞膜的起泡和变形。为了模拟胚胎植入期的嵌合体条件，研究人员在含有10%的Matrigel 的AggreWell 800微孔板中共培养了mEpiSCs和hiPSCs，以促进细胞极化和管腔形成。结果显示，纳米GPI hiPSCs促进管腔形成的能力明显优于野生型hiPSCs。

在体内实验中，研究人员将纳米GPI mESCs注射到GFP-GPI小鼠囊胚中，生成的嵌合体胚胎外观正常，并分化出所有三种胚层的标志物。此外，纳米GPI hiPSCs对异种嵌合胚胎的贡献率显著高于对照hiPSCs，表现为更高的线粒体DNA含量和更高的阳性qPCR阈值。而且，纳米GPI hiPSCs能够在胚胎内分化，并参与三种胚层来源的组织发育。

最后，研究人员考察了纳米抗体介导的细胞粘附是否能解决发育时间差异的问题。先前的研究表明，如果不干预细胞凋亡或细胞竞争，启动的mEpiSCs往往难以参与囊胚嵌合体的形成。研究发现，通过增强细胞粘附，如过表达E-cadherin，可以改善这一问题。实验结果显示，纳米GPI mEpiSCs和处于启动状态的纳米GPI hiPSCs成功地在GFP-GPI小鼠囊胚中形成了异种嵌合体，并分化表达了三种胚层标志物，说明纳米抗体粘附能有效克服发育时间差异，使启动的PSCs在种内和种间环境中都能参与嵌合体的形成。

综上所述，该研究通过开发纳米抗体-抗原策略，改善了不同物种细胞之间的粘附，并提高了人类细胞在小鼠胚胎中的嵌合度。该研究为理解和操控异种细胞粘附提供了新的视角。

模式图（Credit:Cell Stem Cell）