Cell：使用Cas9记载生物变乱颠末的光阴和光阴信息

生物反馈是高度动静的，尤其是在活细胞中。 是以，出人意料的是，活细胞中这种反馈的速度能够足够稳定以被用作钟表体系。 DNA是性命的遗传物资，已被发起作为记载信息的序言。虽然DNA已被用于记载生物学信息和盘算数学识题，但尚未将其用于记载光阴信息。

在这里，咱们发现与典型的动静生物反馈相比，Cas9和gRNA发生的拔出片断可能以稳定的速度产生，而且累积拔出片断的频率是光阴的函数。通过丈量拔出缺失频率，咱们开辟了基于CRISPR-Cas9的合成生物体系，可能以可复制的方式在培育的人类和小鼠细胞以及小鼠皮肤细胞中模拟记载和丈量数小时至数周的相对光阴的办法。这些光阴记载是在几种细胞类型中进行的，Cas9的启动子和递送载体分歧，而且在培育的细胞和活小鼠的细胞中都进行。作为利用，咱们记载了热裸露和炎症发生发火以来化学裸露的继续光阴和颠末的光阴长度，是以咱们的体系可以用作合成的“ DNA clock”。

为了记载颠末的光阴，咱们应用CRISPR-Cas9体系指导拔出缺失的天生，要是稳定地维持Cas9和gRNA的浓度，那么完全的靶序列频率将遵循指数衰减，可通过使用Cas9敲入细胞和U6启动子来驱动gRNA表白来到达稳定浓度。为了精确地丈量各类光阴段的光阴，咱们使用了多个目的序列。先前曾经开辟出高通量办法来确定数千个靶序列的拔出缺失频率。为了简化该办法，咱们通过使用stgRNA编码体系对其进行了批改，此中gRNA编码序列也充任目的序列。此外，为了在更长的光阴内削弱stgRNA的活性以丈量光阴，咱们在领导序列的5‘端加了65 nt的序列（包含15 nt的条形码序列和 50 nt的延伸序列）。

咱们研讨了目的序列的可丈量光阴窗口与其在体系中的半衰期之间的关系，先假如完全的目的频率将落在一个二项式散布中，落后行了300次盘算仿真，发现半衰期会影响可丈量的光阴窗口。

既然可以通过每个目的序列来估量颠末光阴，那么当使用多个靶序列时，在一个光阴点估量了多个光阴长度（图1J）。为了精确地估量某个光阴点的颠末光阴，咱们起首滤出了目的序列，这些目的序列如上所述具备极高的（ 95％）或低的（ 2％）完全目的频率。为了确定从残剩目的序列中得到每个光阴点一个估量的颠末光阴长度的最佳办法，咱们使用四分位数nps加权均匀值来估量多个目的序列的颠末光阴。

咱们起首依据完全目的频率预算反复光阴，该目的频率是依据使用其他反复数据得出的半衰期得出的（保留一个反复的穿插验证），该光阴估量是精确的，证明了咱们颠末的光阴记载体系在一切正本之间都是可重现的。

接上去，咱们通过火析随机选择削减了stgRNA的数目，发现均匀绝对相对误差在年夜约100或200个stgRNA上是可比的，尔后它们跟着stgRNA数目的削减而急剧动摇并添加。这些数据标明，咱们可以使用仅包括100或200个stgRNA的较小的文库进行绝对准确的光阴丈量，削减目的序列和单位格数目对光阴记载精确性的影响。

接上去，咱们评价了在更广泛的环境下是否可以完成对颠末光阴的估量。使用分歧的启动子和分歧的细胞类型记载Cas9表白所颠末的光阴，取代使用克隆扩增的Cas9基因敲除细胞，Cas9表白由来自HEK293T细胞中慢病毒载体的三个分歧启动子（CMV，EFS和PGK启动子）与Cas9基因敲除细胞相比，Cas9在这些慢病毒Cas9转基因细胞系中的表白将加倍异质。

要成为自力的相似时钟的体系，光阴记载体系不该遭到内部情况的影响。为了将咱们的体系裸露在分歧的微情况中，咱们在三维多孔聚苯乙烯支架中培育了经文库2转导的Cas9-敲入细胞，并将其移植到免疫缺点NOG（NOD / Shi-scid / IL2Rgnull）小鼠的皮下区域。标明基于Cas9-knockin细胞的光阴记载体系在在这种环境下，二维体外前提与三维体内前提之间的微情况差别简直没有影响。咱们终极测试了改动因素的组合（即分歧的启动子，细胞类型和微情况）是否会影响光阴记载。为相识决这个成绩，咱们使用了Cas9-knockin小鼠，该小鼠在Rosa26基因座中从CAG启动子表白SpCas9。将慢病毒文库2皮内打针到Cas9基因敲除小鼠的背部皮肤中，并阐发了皮肤组织，该皮肤组织包括多种细胞类型，包含但不限于成纤维细胞，巨噬细胞，脂肪细胞，瘦小细胞，角质造成细胞和干细胞。与下面显示的使用分歧细胞类型和启动子得到的成果类似，咱们察看到了颠末的光阴的估量长度与真实长度之间的线性相关趋向，标明即便几个因素（例如细胞类型，微情况和Cas9表白的启动子）都产生了变动，也可以预算颠末的光阴。

到今朝为止，还没有分子记载仪可能记载“生物变乱产生时”。接上去，咱们试图通过记载变乱产生后颠末的光阴来预算变乱产生的光阴。咱们以相似的方式将光阴距离的器量记载到活人细胞的DNA中，光阴距离从数小时到数周不等。乏味的是，咱们的生物体系和辐射测年都基于指数衰减模子。