Bioresource Technology：颁发定向退化亮氨酸脱氢酶联合表白优化高效制备L

近期，江南年夜学生物工程学院饶志明传授团队在L-2-氨基丁酸的高效制备方面取得紧张停顿，研讨结果“Efficient single whole-cell biotransformation for L-2-aminobutyric acid production through engineering of leucine dehydrogenase combined with expression regulation”正式颁发于Bioresource Technology (IF = 7.539) (https：//doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124665)。

L-2-氨基丁酸（L-2-ABA）长短人造手性氨基酸，普遍用作临盆手性药物的前体，以及用于克制人类神经信息的通报并匆匆进脑细胞的代谢。传统的化学制备办法存在本钱高、净化重大、光学纯度高等缺陷；罕见的法制备L-2-氨基丁酸为“一锅法”，该办法必要独自发酵培育两种以上菌株、严厉节制三种酶（苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶）的增加量，添加了临盆本钱和工艺要求。是以，必要构建多酶级联催化的单细胞来完成统一宿主的多酶共表白。

饶志明传授团队针对L-2-氨基丁酸制备进程中的限速酶——亮氨酸脱氢酶受2-酮丁酸克制作用显明、酶活不高的缺陷以及多酶系统中催化速度不协调的成绩，采取双重战略改革限速步调高效制备L-2-氨基丁酸。起首，通过设计合理的高通量挑选办法进行定向退化旨在进步亮氨酸脱氢酶的2-酮丁酸耐受性及催化活气，树立将溶菌酶消融细胞壁获取胞内酶以及紫外分光光度计检测NADH耗费相联合的高通量挑选办法，构建上千样本数的渐变文库获得一株酶活进步了45%的渐变株X（K72A/M355I/Q361N）；构建单点渐变株验证了该渐变株X的无益渐变点为K72A，其比酶活进步到133.3％且半克制浓度（14.0 g·L-1）也高于家养型（10.5 g·L-1）；对K72位点的饱和渐变文库进行研讨，获得了比酶活别离进步了33.3％、27.8％的K72A、K72W，此中K72A的kcat·Km-1为家养型的2.65倍；GROMACS进行分子能源学模拟，渐变后联合口袋的柔性添加，加强了底物和联合口袋处卵白质残基之间的互相作用。其次，设计分歧强度的RBS序列旨在减弱苏氨酸脱氨酶的表白以协调多酶催化速度，得到苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的多酶级联重组菌E. coli BL21/pET28a-R3ivlA-EsldhK72A-fdh，其产量是未改革菌株的2.6倍。末了，将该菌株用于5 L发酵罐缩小，1 L转化系统中投料L-苏氨酸约150 g，L-2-氨基丁酸的产量达121 g，摩尔转化率达95%，时空产率为5.04 g·L-1·h-1。本研讨为已报道的多酶协同单细胞制备L-2-氨基丁酸的最高产量，为低本钱L-苏氨酸合成高附加值L-2-氨基丁酸提供了一种绿色、高效的合成办法，为有代价的药物的年夜规模合成提供了能够。(100yiyao.com）