上海科技大学高冠军团队开发出一种简单高效的大片段基因敲入编辑器——TEd

来源：生物世界2022-08-16 17:49

这是首次通过引入启动子来修饰HR-供体，以开发用于转录偶联的新基因编辑器TEd。通过一系列优化，TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大敲入时效率低的问题。

CRISPR-Cas系统介导的基因编辑前沿生物技术的发展和应用引起了全世界的关注。依靠HR同源重组的各种基因编辑器已经能够实现精确的DNA插入或基因敲除，不仅促进了生物医学的基础研究，也为许多遗传疾病的治疗带来了巨大的临床应用前景。然而，在哺乳动物细胞中精确插入(或删除)长DNA片段(尤其是10kb以上的片段)的效率非常低，这严重阻碍了CRISRP技术在编辑大DNA片段方面的可行性。

上海科技大学生命学院高冠军团队在《核酸研究杂志》上发表了一篇题为《转录偶联供体DNA表达增加高效基因组在线编辑的同源性重建》的研究论文。

本研究报道了一种简单高效的基因编辑方法，称为TEd (TEd转录偶联编辑器)。研究团队将转录过程引入到传统的HR-donor(HR- donor)中，以改变DNA修复过程中供体的染色质结构，促进同源重组，从而实现细胞内大DNA片段的高效编辑。

研究团队一直从事基因编辑技术的开发和应用，如插入GFP荧光标签。2018年，团队将Cas9和RT逆转录酶在细胞中融合，然后在HR供体颗粒上提供启动子，转录与同源DNA互补的RNA分子，然后测试逆转录酶能否以RNA分子为模板直接合成相应的大片段，从而完成目标基因的高效敲入。

后续研究发现，这种依赖RT逆转录酶的设计，并不能提高大敲入的编辑效率。然而，研究人员意外地发现，转录的HR-供体DNA可以显著促进同源重组和修复。基于此，该团队提出在DNA修复过程中人为引入转录过程，以改变HR-供体的染色质结构，从而测试HR-供体DNA结构的改变能否提高DNA大片段的插入效率。实验在哺乳动物细胞的几个测试基因位点发现，处于转录偶联状态的供体DNA可以显著提高GFP的精确插入效率。团队将其命名为转录偶联基因编辑器TEd。

该团队随后根据上述发现设计并开发了一系列优化的TEd基因编辑系统。通过向同源供体DNA中引入启动子以形成TC-供体(转录偶联HR-供体)，在其转录产物TC-RNA的3末端添加多个MS2茎环，并融合Cas9上的MS2适体的结合结构域(MCP ), 该团队发现，优化后的TEd系统在几个哺乳动物细胞中的编辑效率远高于传统的CRISPR-Cas9介导的编辑方法(mediated方法对GFP的精确插入可以达到传统CEd方法的10倍左右)，在高达10kb的DNA片段分型中也取得了良好的效果(传统CEd方法对于5kb片段的靶向插入非常困难)。 然而，TEd方法的应用受到其TC-供体转录方向的限制。发现TC-供体的转录方向对TEd编辑效率有重要影响。只有当TC-供体的转录产物与gRNA对应的非靶向链互补时，ted介导的基因编辑效率才比经典的CEd方法显著提高，这提醒研究者在后续的实际应用中要注意TEd系统的整体设计。

总之，这是首次通过引入启动子对HR-donor进行改造，开发出一种新的用于转录偶联的基因编辑器TEd。通过一系列优化，TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大敲入时效率低的问题。此外，与传统方法相比，TEd方法在基因缺失、替换和点突变方面有显著改善，为未来TEd在临床治疗中的应用奠定了基础。与此同时，该团队大胆预测，ted转录偶联编辑器可能也适用于其他物种。

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