Nature：基因治疗的“新大陆”!新生儿体内基因治疗的“黄金窗口”

基因治疗的 阿喀琉斯之踵 ：体外操作的挑战

基因治疗（gene therapy）被誉为是21世纪医学的 希望之光 ，它通过修改、添加或删除基因来治疗疾病，尤其在血液学和代谢性遗传病领域取得了令人瞩目的成就。目前，许多基因治疗产品已进入临床试验阶段，甚至已上市。然而，现有的造血干细胞基因治疗主要采用 体外 （ex vivo）方式。这意味着什么呢？

首先，医生需要从患者体内采集造血干细胞，这是一个复杂且侵入性的过程。接着，这些细胞会在体外实验室中进行基因修饰，通常是利用慢病毒载体（Lentiviral vector, LV）将正确的基因导入细胞内。最后，经过基因修正的细胞再被回输到患者体内。在此之前，患者通常需要接受预处理（conditioning），比如化疗或放疗，以清除部分自身有缺陷的造血干细胞，为新导入的基因修正细胞腾出空间。

这种 体外 模式虽然有效，但也存在一些固有的挑战：

细胞获取与操作的复杂性：采集足够数量且功能正常的造血干细胞本身就是一大难题，尤其对于年幼的患者而言。

体外培养的风险：细胞在体外进行培养、扩增和基因修饰，可能面临污染风险，也可能影响细胞的活性和长期功能。

患者预处理的负担：预处理方案往往具有毒副作用，对患者身体造成较大负担，限制了治疗的适用人群，特别是对于虚弱或年龄过小的患者。

局限性： 体外 基因治疗通常只修正造血干细胞本身，而许多遗传病具有全身性表现，需要更广泛的组织器官被修正才能达到理想的治疗效果。

因此，研究人员一直梦想着能实现 体内 （in vivo）基因治疗 直接将基因治疗载体注入患者体内，让载体自己找到并修正目标细胞，从而绕过复杂的体外操作和预处理环节。这无疑将是基因治疗领域的一场革命。然而，如何、高效地将载体递送到造血干细胞的 家园 骨髓（bone marrow, BM）中，一直是困扰研究人员的重大难题。

新生儿的 黄金窗口 ：一项意想不到的发现

为了实现体内造血干细胞基因治疗的愿景，研究团队的目光聚焦在了小鼠的生命早期。他们对C57BL/6小鼠的造血系统进行了时空演化分析，结果发现了一个令人惊喜的 秘密 ：新生小鼠体内，循环造血干细胞（cHSPCs, circulating haematopoietic stem and progenitor cells）的数量异常丰富，且这些细胞正处于从肝脏（liver）向骨髓（bone marrow, BM）大规模迁徙的活跃状态。

具体来看，研究人员对C57BL/6小鼠出生后第0-1天（新生儿）、1周龄、2周龄和8周龄（成年）的骨髓、外周血（PB, peripheral blood）、脾脏（spleen）和肝脏中的造血细胞组成及绝对数量进行了详细分析。结果显示，在新生儿小鼠的外周血和脾脏中，造血干细胞（HSCs, haematopoietic stem cells）的比例明显高于成年小鼠。例如，新生儿小鼠外周血中造血干细胞的绝对数量约为每微升2000个，而到8周龄时则降至约每微升100个。此外，新生儿肝脏中造血干细胞的组成也与骨髓高度相似，并且在幼鼠肝脏的造血灶中观察到了活跃的细胞增殖，包括巨核细胞（megakaryocytes），这都表明肝脏在新生儿早期仍是重要的造血器官。

这些数据描绘了一幅清晰的图景：新生儿期是一个独特的 窗口 ，此时胎儿造血的残余部分仍然存在，大量造血干细胞在血液中循环，并积极地向正在发育成熟的骨髓生态位（BM niche）归巢。这为体内基因递送提供了一个前所未有的机会，慢病毒载体可能更容易接触到并转导（transduce）这些在血液中迁徙的造血干细胞。

基于这一发现，研究人员进行了一项大胆的尝试：他们向新生C57BL/6小鼠静脉注射了表达绿色荧光蛋白（GFP, green fluorescent protein）的慢病毒载体。结果令人鼓舞，这些载体能够稳定地将基因递送到约0.5%的各种血细胞谱系中，并且在脾脏和骨髓中的绿色荧光蛋白标记水平也相当。

为了确认基因转移是否真正发生在具有长期自我更新（self-renewing）能力的造血干细胞中，研究团队进行了骨髓移植实验。他们从慢病毒载体处理过的新生小鼠骨髓中收集了基因标记的细胞，并将其移植到接受过预处理的成年小鼠体内。结果显示，在5只受体小鼠中，有4只成功实现了基因修正细胞的长期植入（engraftment），并且绿色荧光蛋白标记的细胞在所有分析的血细胞谱系和造血器官中均能检测到。更重要的是，通过整合位点分析（integration site analysis），研究人员确认这些基因修正细胞确实来源于真正的造血干细胞。在接受移植的小鼠体内，数百个不同的克隆（clone）共同贡献了造血输出，没有出现单一克隆过度扩增的现象，这表明基因修正的安全性较高。此外，即使在移植一年后，新生儿期接受慢病毒载体处理的小鼠体内的绿色荧光蛋白表达仍保持稳定。

隐形盾牌 与 动员令 ：基因递送效率的优化

尽管新生儿期提供了独特的体内基因治疗窗口，但研究团队并未止步于此。他们继续探索如何进一步提升基因递送效率。

他们首先发现，即使在2周龄小鼠体内，慢病毒载体基因转移效率也显著低于新生儿期，这进一步印证了造血干细胞在新生儿血液中高循环的重要性。为了增加慢病毒载体可及的造血干细胞数量，研究人员尝试了一种在临床上用于造血干细胞动员（mobilization）的方法 使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF, granulocyte-colony stimulating factor）和普乐沙福（plerixafor）处理2周龄小鼠。这种 动员令 的效果非常显著：处理后，循环造血干细胞的数量急剧增加，慢病毒载体的基因转移效率也随之提升，绿色荧光蛋白阳性的CD45+细胞比例平均达到8.5%，是未动员小鼠的5倍。即使在20周后，这些小鼠骨髓、胸腺（thymus）和脾脏中的绿色荧光蛋白表达和载体拷贝数（VCN, vector copy number）仍然保持较高水平。

进一步的实验表明，即使对新生小鼠进行更短的动员方案，也能实现基因转移效率的显著提升，循环CD45+细胞中绿色荧光蛋白阳性细胞比例达到11%，提高了15倍。这提示我们，造血干细胞的 可及性 是影响基因递送效率的关键因素，而动员策略能够有效延长这一 可及窗口 至幼年小鼠。

除了动员策略，研究团队还从慢病毒载体本身入手，寻求优化。他们测试了两种不同的慢病毒载体改进策略：

抗干扰素- （IFN- ）受体阻断抗体（MAR-1）：研究发现，IFN- 会限制慢病毒载体对造血干细胞的体内转导。在新生小鼠体内注射MAR-1抗体，使得绿色荧光蛋白阳性细胞数量增加了2.5倍。这表明阻断IFN- 信号通路能够有效缓解体内转导的限制。

巨噬细胞吞噬屏蔽慢病毒载体（CD47high-LV）：巨噬细胞（macrophage）的吞噬作用是体内慢病毒载体递送效率的另一个障碍。CD47分子是一种 别吃我 （don t-eat-me）信号，高表达CD47的细胞不易被巨噬细胞吞噬。研究团队开发了一种在表面高表达CD47的慢病毒载体（CD47high-LV），就像给载体穿上了一层 隐形盾牌 。在一种对人类CD47信号敏感的非肥胖/严重联合缺陷/白介素2受体 （NSG, non-obese diabetic/SCID/IL2R ）小鼠模型中，CD47high-LV在新生儿小鼠体内的绿色荧光蛋白标记水平比C57BL/6新生儿小鼠或NSG成年小鼠高出四倍。相比之下，使用不表达CD47的慢病毒载体（CD47free-LV）则导致了绿色荧光蛋白阳性细胞的显著减少。这明确证实了 隐形盾牌 策略能有效增强慢病毒载体在造血干细胞中的基因转移。

综合这些发现，研究团队得出结论：新生儿期是体内造血干细胞基因转移的最佳窗口。虽然随着年龄增长，慢病毒载体转导的许可度（permissiveness）会降低，但通过造血干细胞动员和使用CD47high-LV等工程化载体，可以在幼年和成年小鼠中显著提高转导效率。尤其值得一提的是，新生儿和2周龄小鼠对所有剂量的慢病毒载体都耐受良好，没有出现毒性反应，而NSG成年小鼠则出现了剂量限制性毒性。

从实验室到临床：在疾病模型中的惊艳表现

这项体内基因治疗策略的最终目标是应用于临床，解决人类遗传病问题。为了验证其治疗潜力，研究团队在三种不同的小鼠疾病模型中进行了测试，这些疾病涉及不同的造血谱系和/或造血系统外组织。

腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID）：免疫重建的奇迹

腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID, adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency）是一种严重的联合免疫缺陷病，由于有毒腺苷代谢物的积累，导致T细胞、B细胞和自然杀伤细胞分化及功能受损。基因修正的淋巴细胞在ADA-SCID患者体内具有选择性生存优势，且ADA酶在全身表达，修正后的肝细胞可通过解毒作用作为永久性酶替代疗法。

研究团队设计了三种不同表达模式的慢病毒载体：

PGK.ADA：普遍表达ADA酶。

PGK.ADA.122mirT：通过靶向肝脏特异性微小RNA（miR-122）序列，抑制肝细胞表达ADA酶，主要在造血细胞中表达。

ET.ADA.142mirT：利用肝脏特异性增强的甲状腺素运载蛋白启动子（ET promoter）驱动ADA酶表达，并通过靶向miR-142序列抑制造血细胞表达，主要在肝细胞中表达。

他们将这些载体静脉注射给新生ADA-SCID小鼠，并监测其体重和存活率。

生存率：未经治疗的ADA-SCID小鼠在断奶前全部死亡。而经过慢病毒载体治疗的小鼠存活时间更长，生长情况与野生型（WT）小鼠相当。其中，PGK.ADA载体组的长期存活率最高，有5只（共7只）小鼠长期存活，这凸显了肝细胞介导的解毒作用的重要性。ET.ADA.142mirT载体组也有4只（共5只）小鼠存活至20周。

选择性优势与免疫重建：在PGK.ADA载体治疗的小鼠中，循环细胞的转导率达到了7%，而野生型小鼠中仅为2-4%，表现出显著的选择性优势。PGK.ADA载体治疗的小鼠免疫重建速度最快，而其他载体组则较慢。20周后，所有存活的治疗小鼠的脾脏和胸腺组成与野生型小鼠无异，进一步证实了免疫系统的重建。

酶活性：PGK.ADA载体治疗的小鼠红细胞中ADA酶活性是其他组的3倍，这与肝细胞的解毒作用相辅相成。

长期稳定性：移植实验也证实了基因修正的造血干细胞保留了植入潜力。从PGK.ADA载体治疗的ADA-SCID小鼠体内分离的骨髓细胞，能够成功植入受体小鼠并实现长期存活和淋巴细胞计数恢复，且载体拷贝数稳定在0.04左右，证明了长期造血重建干细胞的稳定转导。

这些结果证明，在新生ADA-SCID小鼠体内进行基因治疗是可行的，且包含肝脏和造血细胞双重表达的载体设计具有显著优势。

常染色体隐性遗传性（ARO）：骨骼重塑的希望

常染色体隐性遗传性骨质疏松症（ARO, autosomal recessive osteopetrosis）是一种由T细胞免疫调节因子1（TCIRG1）基因突变引起的严重遗传性骨病，导致破骨细胞（osteoclast）功能缺陷和骨吸收受损。这种疾病会严重限制骨髓造血，导致循环造血干细胞浓度增加。

研究发现，体内慢病毒载体基因转移能够延长骨质疏松小鼠的出生后存活期，并使基因修正的细胞分化为功能性破骨细胞，从而实现骨吸收。然而，由于该模型疾病进展迅速且严重，在现有实验条件下未能完全纠正所有疾病表型。详细结果可在补充材料中查阅。

范可尼贫血（Fanconi Anemia）：骨髓衰竭的逆转

范可尼贫血（Fanconi Anemia, FA）是一种罕见的遗传性疾病，属于DNA修复缺陷综合征，直接影响造血干细胞，导致严重的造血干细胞耗竭和骨髓衰竭（bone marrow failure），并增加癌症风险。幸运的是，临床试验表明，即使少量修正的造血干细胞也能在体内逐步扩增并重建骨髓。

小鼠模型中的表现： 研究团队首先分析了范可尼贫血基因敲除小鼠（Fanca-/-）的外周血，发现在新生Fanca-/-小鼠中，循环造血干细胞的数量非常低，这与人类范可尼贫血患者的情况相似。

选择性优势与骨髓重建：随后，他们向新生Fanca-/-小鼠静脉注射了PGK.FANCA慢病毒载体，并监测外周血细胞中的载体拷贝数。结果显示，在长达一年的监测期内，所有治疗小鼠的载体拷贝数都在生理性生长和稳态造血更新过程中逐渐增加，这有力地证明了基因修正的Fanca-/-细胞在体内具有显著的选择性生存优势。在外周血参数方面，白细胞（WBC）和淋巴细胞计数在大约30周后逐渐恢复正常，这表明基因修正的造血干细胞群体已扩增到足以恢复外周血参数的阈值。

整合位点分析： 在一年随访结束时，慢病毒载体治疗的Fanca-/-小鼠的脾脏、胸腺和骨髓中检测到高载体拷贝数。整合位点分析也进一步证实了载体成功转导了真正的造血干细胞，且这些细胞通过选择性优势实现了扩增。

模拟骨髓衰竭： 为了更真实地模拟范可尼贫血患者的骨髓衰竭，研究人员对Fanca-/-小鼠进行了丝裂霉素C（MMC, mitomycin C）处理。MMC是一种DNA交联剂，对Fanca-/-细胞具有毒性。结果令人振奋：接受慢病毒载体治疗并暴露于MMC的小鼠，修正细胞数量大幅扩增，载体拷贝数最高达到1。而未经治疗的Fanca-/-小鼠在MMC处理后出现严重造血功能下降，完美模拟了患者的骨髓衰竭，但接受基因治疗的小鼠则表现出快速恢复。一年后，这些小鼠骨髓、脾脏和胸腺中的载体拷贝数再次印证了MMC处理选择性压力下修正造血干细胞的扩增。

动员策略的有效性：尽管在幼年和成年小鼠中，造血干细胞基因转移效率远低于新生儿期，但研究团队发现，动员策略能有效提高两个年龄组的基因转移效率，其中2周龄小鼠的载体拷贝数最高。这表明动员策略可延长范可尼贫血治疗的 干预窗口 。

总之，这项研究通过利用修正细胞的选择性优势和初始体内转导造血干细胞群体的逐步扩增，成功实现了范可尼贫血小鼠模型的造血缺陷完全纠正。

从实验室到病床：体内基因治疗的颠覆性前景

这项在小鼠模型中取得的突破性进展，自然而然地引出了一个关键问题：人类新生儿是否存在类似的造血干细胞 黄金窗口 ？

研究团队利用先前发表的多参数流式细胞术分析方法，对健康人出生时、0-2个月、3-8个月以及成年期（大于18岁）的外周血样本进行了评估。结果发现，人类新生儿和婴儿早期也存在一个循环造血干细胞和多能祖细胞（multipotent progenitor cells）的 高峰期 ，无论是在绝对数量还是在总造血干细胞的百分比上都非常显著。具体而言，新生儿的外周血中循环造血干细胞平均约为每毫升3000个，而到3-8个月龄时降至每毫升500个左右，在成年人（ 18岁）中几乎检测不到。多能祖细胞在新生儿中达到峰值，约为每毫升20000个，到3-8个月龄时降至每毫升5000个左右，在成年人中同样几乎检测不到。随着断奶期的到来，这些细胞的数量逐渐下降，到成年期几乎检测不到。

这一发现与小鼠模型的结果高度一致，提示人类新生儿期也可能是一个独特且时间敏感的体内造血干细胞基因治疗窗口。这无疑为未来的治疗策略提供了巨大的想象空间：

绕过体外操作：如果能在新生儿体内直接进行基因治疗，就可以避免复杂的细胞采集、体外操作和回输过程，大大简化治疗流程，降低风险。

避免患者预处理：对于许多遗传病患儿而言，预处理带来的毒副作用是巨大的挑战。体内基因治疗有望在不进行或轻微预处理的情况下实现有效治疗，减轻患儿痛苦。

更广泛的适用性：简化治疗流程、降低毒副作用，意味着基因治疗可能适用于更广泛的患者群体，包括那些因年龄、健康状况等原因无法接受体外治疗的患者。

一劳永逸 的可能：一旦成功地在新生儿体内修正了造血干细胞，这些细胞将伴随孩子一生，持续产生正确的基因产物，有望实现 一劳永逸 的治疗效果。

当然，体内基因治疗在人类临床应用前仍有诸多挑战需要克服。比如，如何确保载体只特异性地递送到目标细胞而不影响其他组织？如何控制载体的剂量以确保安全性和有效性？如何避免潜在的免疫反应？这些都是研究人员需要进一步研究和优化的方向。

生命起点的无限可能

这项研究的重大意义在于，它明确指出了新生儿期作为体内造血干细胞基因治疗的 黄金窗口 ，并提供了概念性验证。尽管目前体内转导率和基因修正造血的程度仍低于体外转导加预处理所能达到的水平，但研究团队在三种严重遗传病小鼠模型中取得了实质性的治疗益处，足以证明这一策略的巨大潜力。

目前，慢病毒载体在临床上已广泛应用，且研究团队使用的载体设计在体内递送方面具有优势。例如，他们先前的工作已经证明了CD47high-LV在非人灵长类动物体内的安全性和耐受性，且其对载体的许可度更高，响应性更好。这项研究还展示了通过早期动员和临床兼容的转导增强剂，如IFN- 受体阻断，可以进一步提高体内造血干细胞基因转移的效率。

特别是对于范可尼贫血这类特殊疾病，体内基因治疗的意义尤为重大。它利用了修正细胞的DNA修复缺陷所带来的选择性优势，使得即使是少量最初体内转导的造血干细胞，也能在长期内显著扩增并重建造血系统。这对于那些造血干细胞储备有限的患者来说，将是一个福音，因为它避免了体外操作这些脆弱细胞的挑战。

随着新生儿基因技术的不断普及，更多遗传性疾病有望在生命早期被出来。这项在新生儿期进行体内造血干细胞基因治疗的策略，无疑为我们提供了早期干预的强大工具。通过绕过当前体外造血干细胞基因治疗的主要障碍，这一策略有望为更多患者提供可及的、改变生命的治疗方案。

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