Nature子刊：清华大学陈国强团队开发新型正交转录突变系统，蛋白质进化速度提升150万倍

来源：生物世界 2025-07-09 11:00

该研究开发的正交转录突变系统具有高突变效率、高特异性和低脱靶率的优点，在实际进化过程中仅用 1 天即可完成以往需要数周才能实现的蛋白质优化过程。

蛋白质定向进化是生物技术领域的重要工具，通过模拟自然进化过程，在实验室中快速优化蛋白质功能。然而，传统方法如易错PCR存在耗时长、效率低、突变库多样性受限等问题。

近年来，基于CRISPR-Cas或T7RNA聚合酶的突变系统虽取得进展，但仍面临突变范围小、宿主普适性窄等挑战。在非模式生物（例如嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis）中，缺乏高效的蛋白质定向进化工具，限制了其在工业生物技术中的应用。如何开发一种高效、高特异性、广宿主兼容且能同时引入多种突变类型的系统，成为亟待解决的难题。

近日，清华大学陈国强教授团队在Nature Communications期刊发表了题为：An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolutionin vivo的研究论文。

该开发了一种正交转录突变系统（OTM）。该系统通过将三种广宿主兼容性的噬菌体RNA聚合酶（MmP1/K1F/VP4）与两种脱氨酶（PmCDA1和TadA变体）巧妙融合，构建了一个高效、模块化的蛋白质进化平台。其核心设计原理在于：RNA聚合酶在转录过程中解旋DNA形成单链区，而融合的脱氨酶则能对暴露的单链DNA进行编辑，实现C:G-T:A和A:T-G:C类型的碱基突变。该系统能在短短1天内完成蛋白质的定向进化，突变效率较自发突变提升达150万倍。

在这项研究中，研究团队采用XTEN柔性连接肽分别将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶与噬菌体RNA聚合酶融合，构建了分别能够产生C:G-T:A和A:T-G:C类型碱基突变的正交转录突变元件。同时通过添加尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）和优化诱导条件，使突变效率提升150万倍，而脱靶率仅增加65倍。

进一步，通过将两种脱氨酶与噬菌体RNA聚合酶进行合理组合，研究团队构建了能够同时引入C:G-T:A和A:T-G:C突变的双功能正交转录突变元件。通过在目标基因上下游分别插入噬菌体启动子，研究人员成功实现了突变在目标基因上的均匀分布，克服了单个启动子策略中突变偏向启动子近端的局限性。

此外，正交性实验结果表明，基于不同噬菌体RNA聚合酶的正交转录突变元件能够特异性识别各自启动子，避免交叉干扰，从而为之后的模块化设计提供可能。在宿主适用性方面，该系统在非模式生物（例如嗜盐单胞菌Halomonas bluephagenesis）和模式生物（例如大肠杆菌E.coli）中均表现出色，解决了现有工具在非模式生物中效率低下的难题。

在实际应用方面，该系统展现了强大的潜力。研究团队通过突变荧光蛋白和色素蛋白，成功获得具有多种不同颜色的细胞；通过靶向突变细胞骨架和分裂相关蛋白，获得了具有超长杆状、球形和其他多种形状的工程菌株，为形态学工程改造提供新的思路；在工业应用场景下，通过一轮突变进化 70全局转录调控因RpoD和赖氨酸外排蛋白LysE，成功获得能够增强L-精氨酸耐受性和转运能力的突变体。

图1. 正交转录突变系统的设计、优化与应用

总的来说，该研究开发的正交转录突变系统具有高突变效率、高特异性和低脱靶率的优点，在实际进化过程中仅用1天即可完成以往需要数周才能实现的蛋白质优化过程。特别值得关注的是，该系统在模式和非模式生物中均展现出优异的性能，有效解决了现有工具在非模式工业菌株中应用受限的困境。

展望未来，该技术仍有广阔的拓展空间和应用前景。一方面可以尝试整合其他突变类型的脱氨酶，进一步丰富突变库的多样性；另一方面可以探索该系统在其他非模式生物中的兼容性和适用性。在应用层面，该突变系统可以应用于加速生物制造（例如PHA生产）中关键酶的优化，推动绿色生物经济发展。

清华大学生命科学学院陈国强教授为论文通讯作者，生命学院2022级博士生邵明威为本论文第一作者。其他作者还包括陈国强实验室的科研助理张忠楠，博士后金晓帆和2023级博士生丁军。相关工作获得了国家和清华北大生命联合中心的基金支持。

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