Neuron︱Leica低压冷冻推翻脑片突触研讨

神经迷信的一个根本成绩是:突触的构造和功效个性之间的关系是什么?在过来的几十年里，电心理学曾经说明了突触的传导机制，而电子显微镜(EM)使人们对突触的形状有了更深化的相识。将突触心理学和超微构造分割起来的办法可以追溯到20世纪中期，目标在于得到突触通报的图像，即从电镜拍摄的静态图片中捕获动静进程。此中一种被称为“闪光与解冻”（flash and freeze）的技术，联合了低压冷冻（high-pressure freezing，HPF），对辨认出的突触前神经元的光产生刺激。

图1“闪光冷冻”示用意本日为年夜家引见一种新颖的、可用于完全的哺乳植物急性脑切片和器官切片培育的疾速和冷冻办法，该办法摸索了小鼠海马齿状回颗粒细胞（gyrus granule cell）与CA3锥体神经元之间的海马苔藓纤维突触（hippocampal mossy fiber synapse）的构造和功效，囊泡池的变动。内容择要

神经迷信的次要重点是进一步懂得突触的构造和功效，以及两者之间的关系。虽然对突触通报的认知有了紧张停顿，但仍有许多成绩没有获得解答。因为中枢突触的分子构成、构造和功效高度多样化，是以对突触进行准确阐发对逾越这些常识鸿沟年夜有裨益。电镜提供了具备级其余空间分辩率，然而它有一个很显明的缺陷便是只能捕获静态图像。为了阐发活标本中的突触，通常使用共聚焦、双光子和超高分辩技术成像，然而这些技术常常用于离体培育的神经元，很难到达足够的分辩率来辨认单个的激活区或单个突触囊泡。是以，想要洞悉中枢突触的构造-功效关系，必要寻觅一项统筹捕获级空间和毫秒级光阴分辩率的技术。与以往报道办法分歧的是，这种改良的“闪光与冷冻”技术，可利用于急性切片和类器官切片培育。这些劣势源于使用了薄的急性切片、改良后的几何构造、复原方案及高温维护和冷冻技术。基于这一根据，这一技术被利用于海马齿状回颗粒细胞（gyrus granule cell）与CA3锥体神经元之间的海马苔藓纤维突触（hippocampal mossy fiber synapse）。苔藓纤维突触具备年夜突触末尾，形状超微构造显明，突触囊泡数目多，囊泡直径变动年夜，存在致密的核囊泡。从心理学角度看，该突触初始开释概率低、突触可塑性高。试验办法

选择公用于研讨突触前神经元的转基因小鼠，Prox1启动子靶向这些样本的齿状回颗粒细胞。将pro1-creert2系与Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠杂交，选择性表白通道型视紫红质。借助免疫荧光和共聚焦显微镜观测EYFP在颗粒细胞中的选择性表白。急性切片制备与器官切片培育方式如前所述，使海马苔藓纤维坚持最佳状态，以用于电心理学和低压冷冻（HPF）试验。起首，对急性切片与器官切片培育中光刺激下的突触传导进行了深化的电心理学特征阐发，以确定“闪光冷冻”试验的最佳参数，比方脉冲继续的光阴和频率。为了婚配EM ICE低压冷冻体系，需注意节制刺激的功率和强度。

图2优化后的“闪光冷冻”技术任务流接上去，借助EM ICE体系进行低压冷冻和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2进行冷冻替代。用杜氏树脂对切片和器官培育物进行包埋，然后用EM UC7冷冻超薄切片机制成超薄切片。末了用透射电镜(TEM)察看样品。依据苔藓纤维的个性和形状差别，在海马CA3区发现了苔藓纤维末尾。重点阐发对照组和试验组中运动区的着位囊泡的数目和直径，以及在半运动区的潜在内吞凸起造成。试验成果

“闪光冷冻”电镜的拍摄的HPF小鼠急性脑片海马CA3区图像如下：A)低倍镜图像显示青苔状纤维轴突(绿色箭头)穿过通明层，CA3锥体神经元树突(蓝色箭头)穿过青苔状纤维，少量青苔状纤维(赤色箭头)位于这些树突和轴突之间。B)高倍镜图像显示苔藓纤维(赤色箭头)布满突触囊泡和苔藓纤维轴突(绿色箭头)。优化后的试验系统保留了急性切片最佳超微构造，可媲美无光学刺激的HPF类器官脑片的超微构造。

图3 HPF急性切片的EM图像成果显示，“未开释”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已开释”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之间有堆叠，即两种囊泡具备独特的构造和功效部门，这为随后突触的疾速内吞作用提供了证据。此外，作者展现了中度刺激后内吞的孔状构造外观，提供了疾速网格卵白自力的内吞机制的构造证据。

图4成果示用意试验论断

这项研讨标明明晰“闪光冷冻”技术的普遍实用性，可用于小鼠海马组织的急性切片和器官切片培育，也可用于包含小脑和脑干在内的多种年夜脑区域的急性切片。

总的来说，这一整体降级后的“EM”技术可用于急性年夜脑切片突触通报进程中的多个光阴节点的囊泡池变动（构造和功效）机制研讨。