刘/傅研制空间连续定向进化系统 实现合成生物元素大规模并行进化

来源：生物世界2022-09-23 15336011

针对合成生物学研究中有效成分缺乏的关键问题，在现有连续定向进化方法的基础上，采用实验与模型模拟相结合的方法，定量研究了宿主菌空间迁移对其噬菌体进化的影响。

合成生物学旨在用工程学的思想改造或创造人工生物系统，以此来认识生命、改造生命、合成生命乃至设计生命。元素作为合成生物系统的基本单元，其数量和功能制约着合成生物学的发展。

传统手段通过挖掘自然生物系统获得的生物元素的性能往往不能满足人们的需求；虽然有潜力通过理性设计开发出全新的生物成分，但还是受到设计能力的限制。利用上帝之手的力量对现有组件进行改造和优化以获得所需功能的定向进化，已经成为合成生物学领域一项重要而关键的平台技术。

2022年9月21日，中国科学院深圳先进技术研究所刘研究组与傅研究组合作，在《分子系统生物学杂志》上发表了题为《利用空间维度实现平行连续定向进化》的研究论文。

本研究定量研究了细菌-噬菌体在空间共同生长和迁移的动态过程，并基于这一定量认识，开发了空间噬菌体辅助连续进化(SPACE)系统，实现了合成生物要素的大规模并行进化。

传统的定向进化方法一般分为两个步骤：构建变异库和筛选。循环迭代需要大量的重复操作，耗费人力、物力和时间。连续定向进化方法利用自我复制的生物，在基因组复制过程中引入突变，利用突变后生物复制和扩增能力的差异变化，实现建库和筛选两个步骤的自动连接和迭代循环，从而减少人类劳动，使定向进化快速化。

2011年，美国哈佛大学刘中达实验室开发了噬菌体辅助连续进化(PACE)，将M13噬菌体的增殖与待进化生物分子的功能联系起来，在一天内实现了数十轮定向进化，大大提高了进化的效率。这是定向进化技术发展的一个里程碑式的突破。PACE已经应用于RNA聚合酶、TALEN、Cas9、碱基编辑器等重要酶的进化。

然而，如果我们想同时进化多个目标蛋白，仍然缺乏一种简单的定向进化技术/方法。另一方面，PACE系统需要连续培养装置(恒化器)、复杂的流速控制和检测设备以及一定的操作技能，普通实验室开展PACE实验并不容易。

新开发的空间噬菌体辅助连续进化(SPACE)系统，将复杂的进化装置简化为每个生物实验室的琼脂平板，很好地解决了这两个问题。

定量宿主-病毒协同迁移系统的演化时空动力学分析

空间系统的开发受到了刘研究组以前关于细菌迁移和定殖的研究的启发(见)。在之前的研究中，团队发现空间膨胀前沿的细菌总是停留在对数生长期，而前沿后面的细菌则停止了定向迁移，继续向高原生长。这难道不是一个移动的恒化器吗(图1A)？

图1:细菌空间扩张过程中的噬菌体感染。一、细菌空间扩展系统与连续培养装置的相似性；b、细菌-噬菌体共迁移实验示意图；c、实验结果

研究团队最初使用这种移动恒化器来代替PACE系统中连续噬菌体扩增所需的连续培养装置，从而大大简化了系统。研究团队构建了细菌-噬菌体共迁移的实验体系，使宿主细菌携带的原本不动的噬菌体在空间扩张过程中，广泛扩散。由于感染菌的生长速度比未感染菌慢，最终在软琼脂表面的菌苔上产生一个细菌密度较低的扇形感染区(图1BC)。虽然宿主-病毒共迁移系统在自然界中无处不在，但对病毒在迁移过程中如何进化却知之甚少。

为了解这一过程，刘研究组与傅研究组合作，在经典传染病模型SIR(易感、感染、恢复)的基础上，结合细菌空间扩展运动模型，建立了空间扩展系统的宿主感染模型(范围扩展与易感感染恢复)。

ered kinetics）（图2）。该数学模型刻画了空间扩张体系下细菌-噬菌体共迁移的时空动力学，解释了扇形噬菌体感染区的形成过程（图1C）。结合模型模拟与定量实验，研究团队发现扇形感染区的面积与噬菌体感染并产生子代的能力呈正相关关系，这使噬菌体感染能力的强弱有了直观的可视化表征方式。

图2：空间扩展过程中噬菌体与细菌互作动力学模型。A,细菌SIR三种状态的转化及噬菌体生产的数学描述；B,感染动态在不同位置和方向上的差异性；C,模型模拟噬菌体感染区的形成动态；D,模型模拟强弱噬菌体初始比例为PS:PW=1:105 的空间竞争

随后，研究团队利用理论模型结合实验进化的方式，解析细菌迁移过程中噬菌体感染宿主的进化动力学。对于宿主而言，它们的进化主要发生在扩展运动的前锋中，这种现象被称为空间分选进化（spatial sorting）。

研究团队一开始认为病毒的进化也主要发生在同样的位置。然而，后续研究中团队观察到了与该预期截然不同的结果：与更高的感染能力相关的噬菌体有益突变快速积累的位置并不是在宿主运动的前锋中，而是沿着扇形感染区域的侧边沿。该现象产生的原因与侧边沿处存在的非平衡的感染状态有关。这一发现可能也适用于其它生态系统的宿主/病毒共迁徙现象。

理性设计构建空间连续定向进化系统

基于上述定量理解，团队设计构建了SPACE系统（图3）。为了适应SPACE在半固体培养基中的应用，对宿主菌携带的一个关键诱变质粒进行了功能改造，使具有诱变效果的基因只在宿主细菌被噬菌体感染之后表达。未进化的初始噬菌体感染能力很弱，几乎不能在宿主细菌的空间扩展过程中形成可见的扇形感染区。如果诱变过程中其携带的待进化基因产生了有益突变，则可以产生感染能力增强的子代噬菌体，从而使其感染区域面积显著扩大。

图3：SPACE系统的构建。A, 利用噬菌体休克蛋白（phage shock protein, psp）启动子改造诱变模块；B, psp启动子仅在存在噬菌体感染的条件下启动表达；C,SPACE系统基因线路设计；D,T7 RNA聚合酶进化前后识别目标启动子的活性变化

SPACE实现大规模平行定向进化

SPACE系统具有可视化、简便的优势，可以实现大规模平行进化实验。研究团队利用该系统平行进化了T7 RNA聚合酶识别随机启动子序列的能力（图4），获得了一系列启动子变体-RNA聚合酶突变库，可用于进一步改造及工程应用。

图4：利用SPACE进行大量平行进化。A,平行进化T7 RNA聚合酶对人工启动子库识别活性的实验示意图；B,进化获得的能够识别目标启动子的聚合酶突变体

这项工作着眼于合成生物学研究中可用元件匮乏这一亟待解决的关键问题，在现有连续定向进化方法的基础上，通过实验与模型模拟相结合的方式定量研究了宿主细菌的空间迁移运动对其噬菌体进化的作用规律，并由此利用空间维度发展了蛋白质等生物分子的连续定向进化方法，示范了定量合成生物学的研究范式。SPACE系统可以在普通实验室中实现生物元件的大规模平行进化改造，为合成生物学在化工、医疗等领域的应用提供丰富的元件库。同时，细菌空间迁移运动对噬菌体进化的作用规律，也将对于研究更高等的生物如昆虫、鸟类的迁徙对其携带的可能对人类健康也存在影响的病毒如何进化等生态学理论或调查研究提供参考和示范。

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