NAR:胡佳芝/徐默团队分析载体基因编辑的安全性和潜在风险

来源：生物世界2022-10-24 09336030

近年来，新一代基因编辑工具如CRISPR-Cas在肿瘤免疫治疗和体内基因治疗中显示出巨大的应用前景。

近年来，新一代基因编辑工具如CRISPR-Cas在肿瘤治疗和体内基因治疗中显示出巨大的应用前景。基因编辑工具的优化可以经历三个时期：一是编辑效率和应用范围的提高和扩大；第二，脱靶活动的抑制；第三，要注意基因编辑的基因组毒性，主要是指染色质结构变异。染色体结构变异包括染色体易位和大规模DNA丢失。染色体结构变异严重威胁基因组的稳定性，干扰细胞的正常生命活动，从而促进细胞死亡、恶性增殖和癌变等。比如，很多都是染色体易位造成的。

2021年，NIH体细胞编辑项目组在《自然》杂志上撰文，强调关注基因编辑引起的染色体结构变异的重要性和必要性。同年，美国同种异体治疗学公司开发的CAR-T细胞疗法的临床研究被紧急叫停，原因是在被输注了万能细胞的患者体内发现了基因编辑导致的染色体易位。

据北京大学胡家志研究组前期研究，在用于肿瘤治疗的通用CAR-T细胞中，Cas9同时编辑多个位点，会导致靶位点之间以及靶位点与基因组其他部分之间高达2%的染色体易位，可在体外连续检测2周。然而，基因编辑注入体内后导致T细胞染色体结构异常的命运仍然是一个空白领域，阻碍了基因编辑在临床上的大规模应用，成为继续悬在相关领域头上的达尔穆斯之剑。

近日，北京大学生命科学学院、生命科学联合中心胡加志研究组、北京生命科学研究院/清华大学生物医学交叉研究所徐默研究组在《核酸研究》杂志上在线发表了题为：CRISPR/cas 9-induced structural variations expansion in T淋巴细胞体内扩增的研究论文，全面、定量、长期地跟踪分析了基因编辑注入小鼠体内后引起的T细胞染色体结构异常的动态变化。

本研究发现，基因编辑引起的染色体易位、染色体丢失和病毒DNA插入在2个月内并没有随着时间的延长而消失，而是维持在较高水平并表现出明显的随机克隆和扩增现象。特别值得注意的是，有些结构变异在体内甚至可以扩增到数万个拷贝，一开始就有恶性扩增的迹象。

研究小组利用徐默研究组此前建立的小鼠肠炎模型，在体内研究过继T细胞中基因编辑引起的染色体结构变异的命运。在该系统中，只有表达特异性识别肝螺杆菌细菌抗原的TCR的T细胞在体外被激活并被Cas9编辑。成功编辑的细胞将被注入已被肝螺杆菌建群的免疫缺陷小鼠，从而诱导T细胞依赖性肠炎(图1)。这种炎症过程与TCR-T或CAR-T细胞介导的治疗高度相似。然后，研究团队利用胡家志研究组前期开发的高灵敏测序方法PEM-seq，对Cas9编辑的T细胞在输注前、输注后3周、2个月染色体结构异常的比例和分布特征进行了跟踪和定量分析。

图一。HH7-2tg小鼠模型模拟TCR-T细胞编辑和输注治疗。

以危害最大的染色体易位为例，作者发现编辑T细胞携带的染色体易位约占输注前主编事件的1%(图2A)，与此前在人体CAR-T细胞中的结果相当，意味着一次CAR-T细胞治疗中至少会有数百万携带染色体易位的T细胞被注入患者体内。注射到小鼠体内3周和2个月后，染色体易位水平分别维持在0.2 ~ 3.36%(7只小鼠中只有1只为3.36%，其余6只小鼠最高为0.79%)和0.17~0.59%(4只小鼠)(图2A)。这一发现纠正了PCR早期发现的敏感性和准确性有限的领域，结构异常，如染色体易位将随之而来

此外，Cas9编辑的T细胞中的染色体易位在输注前相对均匀地分布在基因组上。然而，在3周或2个月后注射到小鼠体内的T细胞中的染色体易位主要由几个到几十个染色体易位事件组成，这表明这些染色体易位随着T细胞的增殖而被克隆扩增(本研究中发现了128个克隆扩增的染色体易位)(图2B)。特别值得注意的是，在一只小鼠中发现了20615个克隆(占所有染色体易位事件的72.2%)，这导致染色体易位水平比输血前增加了2.4倍(图2C)，表明这种染色体易位可能促进细胞获得某种生长优势(图2D)。

图二。PEM-seq用于检测炎症T细胞中染色体易位的比例和高频位点。

与染色体易位类似，研究小组在基因编辑导致的目标位点发现了一大段DNA。

丢失和病毒DNA插入在输注至小鼠体内前后均分别维持在相近的水平，且表现出随机克隆扩增的特点。同样，在一只小鼠中发现一个病毒插入事件可产生30401个克隆，并导致其病毒DNA插入水平相比于输注前增高了近2倍（图3）。

图3、PEM-seq鉴定炎症T细胞中病毒DNA整合及单个病毒DNA位点所占比例

综上，该研究发现基因编辑导致的染色体易位、靶位点的大片段DNA缺失和病毒DNA插入等严重危害基因组稳定性的副产物，在输入至小鼠体内后的2个月内，不仅不会消失，反而在每只接受输注的小鼠（共计16只）中均有部分染色体结构异常发生了剧烈的随机克隆扩增。不仅如此，相比于输注前，该研究在4只（25%）接受输注的小鼠中检测到了更高水平的染色体易位，提示携带有染色体结构异常的T细胞的异常增殖可能会高频发生。

因此，该研究不仅为淋巴瘤或白血病中致癌性染色体易位在体内的发展历程提供了启示，而且还提示了采用PEM-seq等方法持续追踪检测基因编辑依赖的过继性细胞疗法（如通用型CAR-或TCR-T，基因编辑后的HSC或胰岛细胞等）或在体基因治疗（黄斑病变等）中基因编辑产物在体内动态变化及命运的必要性。此外，该研究还启示使用更安全基因编辑工具的必要性，如可将染色体结构异常降低至背景水平的等。

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