Mol Cell

在前期的研究中，作者观察到长3 UTR转录本会滞留于nuclear speckles（核斑）。考虑到m6A修饰复合物的组分也在nuclear speckles富集，作者提出假设：滞留于nuclear speckles的长3 UTR转录本会进一步在转录后发生m6A修饰，从而造成m6A修饰水平和RNA的3 UTR长度呈正相关；而通过sequential polyadenylation的第二步切割，则会造成同一个基因的短3 UTR转录本而不是长3 UTR转录本被m6A所修饰。由于以前的报道认为m6A修饰主要是共转录发生的，作者首先鉴定了m6A修饰能否在转录后进一步发生？为此，作者在前人开发的m6A-LAIC-seq【3】和GLORI【4】的基础上，结合新生RNA标记技术，开发了4sU-m6A-LAIC-seq和4sU-GLORI方法。通过比较新生（nascent）RNA，包括无polyA尾和带有polyA尾的新生RNA，以及稳定状态（steady-state）下的RNA的m6A水平，作者发现转录后m6A修饰是一个普遍的现象（图2），而且相比较于未发生转录后m6A修饰的RNA，发生转录后m6A修饰的RNA在稳定状态下m6A修饰水平更高。

进一步，作者为了证明RNA的核滞留能够增强m6A修饰水平，一方面构建了HBB-gDNA（含有intron）和HBB-cDNA（不含intron）报告质粒：两个reporter最终产生的RNA序列完全一样，但只有HBB-gDNA来源的RNA能够有效转运出核，而HBB-cDNA来源的RNA则会滞留于细胞核内；另一方面，利用AID2系统对mRNA转运出核因子NXF1进行快速降解以诱导mRNA核滞留。

随后，分别对Reporter来源的 RNA和内源基因来源的RNA进行GLORI定量。单个reporter和转录组规模的实验结果都证明了RNA的核滞留确实能够提高m6A的修饰水平，这也暗示着长3 UTR也有可能通过RNA核滞留增强m6A修饰水平。鉴于渐进式可变多聚腺苷酸化的发生是由于近端polyA位点弱于远端polyA位点，作者进一步通过改变近端polyA位点的强度以破坏或保留渐进式可变多聚腺苷酸化的发生，得到的实验结果进一步表明渐进式可变多聚腺苷酸化可以促进m6A修饰。

渐进式多聚腺苷酸化与核滞留共同决定转录后m6A修饰(Credit:Molecular Cell)

综上，该研究提出了渐进式多聚腺苷酸化与核滞留共同决定转录后m6A修饰的新机制：在渐进式多聚腺苷酸化过程中，远端polyA位点加工产生的长3 UTR转录本滞留于细胞核内，额外的核滞留时间使得m6A修饰复合物可以在转录后对mRNA继续进行修饰，从而进一步提高其m6A修饰水平（图2）。该研究为理解m6A等修饰与APA调控提供了新思路，为解决领域冲突提供了新视角。