Nat Chem：陈加余团队系统揭示三链体DNA互作蛋白调控机制与功能多样性

当前，三链体DNA调控蛋白的发现及其分子机制解析主要依赖体外实验，其准确性和可推广性有待商榷。为实现在活细胞中系统捕获内源三链体DNA互作蛋白，作者开发了特异性识别三链体DNA的光交联化学探针photoBQQ。该探针在Benzoquinoquinoxaline（BQQ）分子的基础上增加了双吖丙啶（diazirine）和炔基（alkyne）基团。双吖丙啶具有紫外光交联活性，而炔基基团可通过点击化学反应连接生物素，以便后续富集。作者通过一系列体外和体内实验证实了photoBQQ探针对三链体DNA的特异性识别能力及其对三链体DNA调控蛋白的临近标记活性。利用该探针，作者在HeLa和A549细胞系中开展了化学蛋白质组学研究，特异性捕获并通过定量质谱成功鉴定了78个高置信度的三链体DNA互作蛋白，为理解三链体DNA的动态调控机制奠定了坚实基础。

随后，作者通过多组学数据（ChIP-seq，CUT Tag，S1-END-seq等）的联合分析揭示了这些调控蛋白的分子调控机制及潜在生物学功能。作者对这些蛋白的DNA结合位点与三链体DNA形成区域进行了系统比对，识别出三种截然不同的结合模式（图1）。不同结合模式对应不同的调控机制和生物学过程。值得注意的是，先前研究难以区分内源性三链体DNA的构型，而该研究通过分析单链多聚胞苷酸结合蛋白HNRNPK、PCBP1和PCBP2的结合模式，推断出内源性三链体DNA主要采用H-r3构型。

该重要发现也解决了HNRNPK、PCBP1和PCBP2蛋白的DNA结合位点相较于其RNA结合位点存在偏移的这一领域内悬而未决的难题【6】。此外，HNRNPK、PCBP1和PCBP2蛋白的转录调控功能或许也与其结合内源性三链体DNA的活性密切相关【7】。

图1 三链体DNA调控蛋白的不同结合模式(Credit:Nature Chemistry)

最后，作者以新发现的三链体DNA调控蛋白DDX3X为例，进行了深入的分子机制研究。通过体外解旋酶实验，作者发现DDX3X能够以不依赖ATP的方式解旋三链体DNA，并且尤其偏好第三链5 端存在额外单链DNA（5 overhang）的三链体DNA。据作者了解，DDX3X是迄今为止发现的唯一一个ATP非依赖的三链体DNA解旋酶。进一步的荧光实验显示，DDX3X缺失会导致三链体DNA的累积并诱发DNA损伤。通过CUT Tag实验，作者发现DDX3X调控的三链体DNA与DNA损伤位点高度共定位。最后，通过连接介导的PCR实验（LM-PCR）证实，DDX3X缺失导致DNA损伤的分子机制是三链体DNA区域发生双链断裂（图2）。这些发现为理解 DDX3X 在各种生理过程和疾病中的分子机制提供了新思路。

总之，该研究首次系统地揭示了内源性三链体DNA调控蛋白的全景图，不仅为深入理解三链体DNA的动态调控奠定了基础，也为诸多蛋白的分子功能研究提供了全新视角。这一研究还为探索三链体DNA的生物学功能及其在转化医学中的应用提供了宝贵资源。

图2 化学蛋白质组学鉴定到的DDX3X通过解旋三链体DNA防止DNA损伤(Credit: Nature Chemistry)