Nature Methods：蛋白质“变形金刚”设计指南——AI“脑补”自然进化，一键生成智能分子开关

蛋白质世界的 混搭 与工程师的 无从下手

要理解这项研究的巧妙之处，我们首先来看下蛋白质的构造哲学。许多蛋白质并非一个完整的整体，而是由多个相对独立的结构和功能单元 结构域(domains) 像乐高积木一样拼接而成。在数亿年的进化长河中，大自然这位最伟大的工程师，最擅长的就是 混搭 这些结构域，创造出功能千变万化的新蛋白质。

其中一种极为强大的 混搭 策略，就是结构域插入(domain insertion)。这并非简单的将两块乐高积木首尾相连，而是将一个结构域（我们称之为 插入结构域 ，insert domain）完整地嵌入到另一个结构域（ 亲本结构域 ，parent domain）的内部。这种 你中有我 的紧密耦合，使得两个结构域在结构和功能上产生了深度的相互依赖。一旦插入结构域的构象发生变化（例如，因为它结合了一个小分子或感受到光），这种变化就可能通过机械力传导给亲本结构域，从而像多米诺骨牌一样，开启或关闭亲本结构域的功能。

这正是设计变构蛋白开关的黄金策略。理论上，我们只要找到一个合适的感应结构域（如光敏结构域或药物结合结构域）和一个我们想控制的功能结构域（如一个酶或一个基因编辑器），然后将前者插入后者的某个关键位置，就能创造出一个光控或药控的分子开关。

但理想很丰满，现实很骨感。这个 关键位置 到底在哪？蛋白质的氨基酸链条长短不一，从几十到几千个氨基酸不等，可能的插入位点成千上万。大多数插入都会直接破坏亲本蛋白质的折叠和功能，导致其彻底失活。只有极少数的 幸运 位点，不仅能容纳一个外来的结构域，还能有效地将感应结构域的构象变化传递出去，实现变构调控。找到这些万里挑一的 变构热点 (allosteric hotspots)，是蛋白质工程师们面临的核心难题。过往的研究表明，即便是那些暴露在蛋白质表面、看起来很灵活的环区(loops)，也只有一小部分能容忍结构域插入。传统的方法因为对蛋白质动态构象的理解有限，预测效果不佳，最终还是得回到实验室进行繁琐的筛选。

从 进化漏洞 到 设计圣经 ： ProDomino的诞生

面对这一困境，研究人员转换了思路：既然人工设计这么难，我们何不向大自然学习呢？

他们推测，在自然界中偶然发生的 结构域插入 事件，虽然可能像进化过程中的 Bug ，但这些成功存活下来的 Bug ，本身就是一份完美的 工程说明书 。它们用活生生的例子告诉我们：在何种蛋白质的何种位置，可以成功地进行结构域插入。

于是，一个宏大的计划诞生了：创建一个关于天然结构域插入事件的大规模数据库，然后用它来训练一个机器学习模型。研究人员首先从庞大的Interpro蛋白质数据库和CATH结构域分类数据库出发，通过复杂的计算流程，筛选出了174,872个独特的天然结构域插入案例。这个数据集横跨整个生命之树，涵盖了202个不同的插入结构域超家族和168个不同的亲本结构域类型。

分析这个数据集本身就带来了一些有趣的发现。比如，最 滥情 的亲本结构域是P-loop NTPase，它可以和13种不同的插入结构域 配对 ；而最 百搭 的插入结构域则是PDZ 结构域，它能被插入到11种不同的亲本中。更有趣的是，这些自然插入事件似乎是普遍现象，并未偏向于特定的蛋白质类型，这说明其背后的物理化学规律是普适的。

有了这份 设计圣经 ，下一步就是训练AI了。研究人员采用了当时最先进的蛋白质语言模型之一ESM-2。你可以将ESM-2理解为一个精通 蛋白质语言 的翻译大师，它能将一个蛋白质的氨基酸序列，转化为包含丰富结构和功能信息的数学表达 嵌入(embeddings)。这比传统的独热编码(one-hot encoding)提供了远为丰富的信息。

他们将这些高质量的嵌入向量，输入到一个相对简单的神经网络中，模型的任务是：对于蛋白质序列中的每一个氨基酸位置，预测它是否是一个 耐受插入 的位点。在训练过程中，研究人员还巧妙地使用了一种位置掩码(positional masking)策略，让模型在每次学习时，只关注一个已知的正确插入位点和一个随机选择的负样本位点。这种做法，既解决了数据中正负样本极度不平衡的问题，也迫使模型更专注于学习区分 好 与 坏 位点的细微差别。

经过这一系列精心设计，一个强大的蛋白质结构域插入位点预测器 ProDomino (Protein Domain Insertion Optimizer) 就此诞生。

牛刀小试：在已知地图上，AI能否找到宝藏？

一个新模型是骡子是马，得拉出来遛遛。研究人员首先选择了一个已经被 前人 详细研究过的蛋白质 细菌转录因子AraC 作为ProDomino的第一个考场。在之前的研究中，科学家们已经通过实验手段，地毯式地筛选了AraC上几乎所有的插入位点，绘制出了一张详尽的 插入耐受性地图 。

ProDomino能否在不看这张 地图 的情况下，独立地找到上面的 宝藏 ？

结果令人振奋。ProDomino对AraC序列的预测分数曲线，呈现出几个明显的峰值。其中最高的两个峰值，恰好对应了AraC上两个已被实验证明的、能够实现强大变构调控的位点：I113 和 S170。更严格的评估指标 受试者工作特征曲线下面积(AUROC) 给出了0.84的高分。这表明，ProDomino不仅能找到 可以 插入的位点，更有潜力直接定位到那些能实现功能开关的 黄金 位点。这场牛刀小试，有力地证明了ProDomino的预测能力。

光影魔术手：用AI点亮 开关 ，实现精准时空猎杀

在已知地图上找到宝藏固然可喜，但在未知世界里开疆拓土才是真正的挑战。研究人员决定将ProDomino应用于全新的蛋白质，目标是设计出光控的 分子开关 。

他们选择了两种常见的抗生素抗性酶：嘌呤霉素乙酰转移酶(PAC)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。这两种酶能让细胞分别抵抗嘌呤霉素和氯霉素的毒性。他们的目标是：通过插入一个光敏结构域AsLOV2（它在蓝光照射下会发生构象变化），让这两种抗性酶变成 光控 的 比如，黑暗中保持活性，蓝光下失活。

ProDomino迅速给出了预测。在PAC中，它指向了E83附近区域；在CAT中，它则锁定了K136位点。这两个位点都位于蛋白质表面的 - 连接环上。

研究人员按照 AI设计图 施工，将AsLOV2结构域插入到了预测的位点。实验结果堪称完美：

在表达光控PAC的人类细胞中，黑暗条件下细胞能抵抗嘌呤霉素的攻击而存活；一旦用蓝光照射，PAC失活，细胞在48小时内纷纷死亡。在表达光控CAT的大肠杆菌中，黑暗中培养的细菌能够正常生长，而在蓝光下培养的细菌则几乎完全停止生长，两者在培养7小时后的光密度(OD)值相差了近20倍。

最令人惊叹的是一个空间控制实验。研究人员将表达光控CAT的细菌均匀铺在培养基上，然后用一个刻有图案的光掩膜(photomask)从下方进行照射。结果，只有在被掩膜遮挡的黑暗区域，细菌才能生长，完美地 复刻 出了掩膜的图案。这生动地展示了AI设计的分子开关所能达到的精准时空控制能力。

为了更全面地评估ProDomino的可靠性，研究人员还测试了多个高分和低分预测位点。结果显示，模型预测的成功率高达78%。高分预测的位点大多能成功构建出有活性的融合蛋白，而低分预测的位点则大多导致蛋白质失活。这表明，ProDomino的预测分数，是指导实验设计的可靠指标。

终极试炼场：驯服 基因魔剪 CRISPR，从 光控 到 药控

如果说设计单结构域酶的开关是 困难 模式，那么改造像CRISPR-Cas这样由多个结构域组成的复杂分子机器，无疑是 地狱 模式。CRISPR系统是基因编辑领域的明星工具，如果能给它装上一个精准的开关，实现 指哪打哪 和 随时开关 ，将极大地提升其安全性，对基因治疗意义重大。

研究人员首先向最著名的SpCas9系统发起了挑战。此前，已有研究通过大规模的转座子筛选实验，绘制了Cas9的插入图谱。ProDomino的预测结果与该图谱有相当高的一致性 (AUROC为0.71)，但同时也预测了几个实验未能发现的、具有高插入潜力的 新大陆 。

研究人员挑选了四个这样的 争议位点 ，将AsLOV2光敏结构域插入其中，并与一个转录激活结构域VPR相连，构建成光控的基因激活工具(dCas9-VPR-LOV2)。实验结果再次验证了AI的 远见 。这四个全新的光控Cas9变体，均表现出良好的插入耐受性，并且其中三个展现出强大的光响应性：在黑暗中能高效激活下游基因的表达，其活性是光照下的8倍到14倍之多。

如果说改造Cas9还只是锦上添花，那么对Cas12a系统的改造，则真正展现了ProDomino解决 从无到有 问题的强大能力。Cas12a是另一种重要的基因编辑工具，其单链结构使得设计可控开关的难度更大，此前鲜有成功案例。

ProDomino对MbCas12a（一种Cas12a的直系同源物）的预测图谱呈现出多个峰值，暗示其对结构域插入的耐受性可能更强。研究人员首先测试了多个高分和低分位点的插入耐受性，再次确认了ProDomino预测的可靠性。

随后，他们进入了最终的设计环节。这一次，他们不仅要实现 光控 ，还要挑战 药控 。

光控Cas12a：他们选择了活性最好的N1153位点，将AsLOV2插入其中。得到的Cas12a-LOV2杂合蛋白表现出显著的光依赖性，在光照下其基因编辑活性会降低到黑暗条件下的三分之一，成功实现了光控的基因编辑。

药控Cas12a：这是本次研究的华彩乐章。研究人员将光敏结构域AsLOV2，替换为人类糖皮质激素受体2的配体结合域 (GR2)。GR2在没有结合其配体 一种临床常用药物皮质醇(cortisol) 时，结构松散；结合皮质醇后，则会折叠成紧凑的构象。研究人员希望利用这种 药物诱导折叠 的特性，实现对Cas12a的 激活 控制。他们将GR2插入到K487和N1153这两个活性位点。

实验结果令人瞩目。尤其是N1153位点的Cas12a-GR2变体，展现出了近乎完美的开关特性。在没有人为添加皮质醇的情况下，它的基因编辑活性几乎为零，接近检测极限；而一旦加入皮质醇，它的活性便 一飞冲天 ，在多个内源基因靶点上，其编辑效率能够达到野生型Cas12a的50%至70%。这意味着，研究人员成功地创造出了一种高效、紧密且由临床药物控制的 安全锁 版基因剪刀。

从 大海捞针 到 按图索骥 ：重塑蛋白质工程的游戏规则

ProDomino的成功，标志着蛋白质工程领域一个设计范式的转变。它将蛋白质开关的设计，从依赖直觉和大规模筛选的 手工作坊 模式，推向了由数据驱动和模型指导的 智能制造 时代。

这项研究的价值远不止于创造了几个新奇的分子工具。

速度与效率：研究人员在论文中提到，整个实验验证过程 从克隆所有候选蛋白到完成各种检测 仅用了约6个月时间。这与过去为了一个项目耗时数年才能成功的经历相比，是巨大的飞跃。

普适性与可及性：ProDomino的成功并非局限于某一类蛋白质，它在结构和功能迥异的多种蛋白质（转录因子、酶、基因编辑器）上都取得了成功，展示了其广泛的应用潜力。它使得设计定制化的生物传感器、可控的细胞疗法和前沿的科研工具，变得前所未有的高效和可预测。

思想的启迪：ProDomino的核心，是向自然学习。它证明了，蕴藏在海量生物数据中的进化信息，是解决复杂生物学设计问题的金矿。人工智能，正是我们挖掘这座金矿的强大工具。

未来，我们可以想象，将ProDomino与基于结构的预测工具相结合，或者与从头设计全新开关结构域的方法相结合，将进一步释放其潜力。蛋白质工程师们将不再是黑暗中摸索的探险家，而是手持AI绘制的精准地图，自信地走向下一个设计目标的领航员。

生命的设计语言，深奥而复杂。但现在，有了AI这位精通进化语法的 翻译 ，我们正以前所未有的速度，破译着这本天书，并开始书写属于我们自己的新篇章。

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