Cell子刊：研讨报道基于荧光探针Aequorin的正向遗传挑选体系

中国迷信院分子动物迷信杰出立异中间研讨员赵杨研讨组和河南年夜学传授朱晓红单干在Cell子刊STAR Protocols颁发了题为Screening for Arabidopsis mutants with altered Ca2+ signal response using aequorin-based Ca2+ reporter system的研讨论文，具体引见了挑选拟南芥Ca2+旌旗灯号缺点渐变体的办法与详细的试验流程。该文章应用两种分歧的遗传配景，树立了两套优化的正向挑选体系，这两种办法均采取基于Aequorin的Ca2+荧光监测。

动物必要整归并相应内部情况旌旗灯号和外部细胞间旌旗灯号，调控其成长与发育。旌旗灯号的通报次要包含旌旗灯号输出、感触及传导、旌旗灯号输入等进程，此中旌旗灯号输入可分为生化反馈、细胞和组织的顺应性反馈等。动物受体激酶介导多种旌旗灯号的感知，其介导的晚期的生化反馈次要包括激酶级联磷酸化反馈、Ca2+和ROS旌旗灯号等。动物若何感知并相应外界和细胞间旌旗灯号始终是广受存眷的迷信成绩，但迄今只发现部门情况旌旗灯号和细胞间旌旗灯号的受体以及下游旌旗灯号调控因子。

Ca2+旌旗灯号在动动物细胞感知刺激后瞬时发生，称为Ca2+旌旗灯号相应（1s内，继续约2-5min），是今朝少数可用于挑选的晚期细胞刺激旌旗灯号相应之一。今朝已知多种刺激可以诱导Ca2+旌旗灯号，包含情况旌旗灯号中的浸透、盐、重金属、温度、挫伤等，以及多种起源于动物或许病菌的效应分子，例如H2O2、ATP、氨基酸、鞭毛卵白、脂多糖和醌类等。应用Ca2+相应作为切入点，研讨职员发现了多种旌旗灯号的受体或许下游旌旗灯号元件，例如，胞外H2O2和动物醌类物受体HPCA1/CARD1、脂多糖受体LORE、胞外ATP受体DORN1等。然而，基于Aequorin的Ca2+荧光监测有敏锐渡过低的缺陷，招致渐变体挑选与基因克隆难度较年夜，尚未获得普遍利用。

第一种挑选系统基于AEQsig6资料，通过喷施Coelenterazine预处置，检测Ca2+荧光旌旗灯号相应，该办法实用于子叶Ca2+旌旗灯号缺点渐变体的挑选和鉴定。Aequorin的生物光峰值位于叶绿素b最年夜排汇波长范畴。为削减拟南芥幼苗中叶绿素的烦扰，研讨职员将Aequorin申报体系引入到具备白化子叶表型的sig6渐变体中，获得AEQsig6资料。是以，AEQsig6具备更强的Ca2+荧光相应。应用该办法，赵杨研讨组发现Ca2+相应的磷脂联合卵白OSMO1/BON1作为下游旌旗灯号元件介导动物整体浸透钳制应对（Current Biology，2020）。

第二种挑选系统基于Ubiquitin启动子驱动表白的Aequorin申报体系（AEQub），应用膜黏着幼苗（Film Adhesive Seedling）系统，通过Coelenterazine溶液孵育处置，Ca2+荧光旌旗灯号相应更为均一，差别可比性高，且该系统可以同时展现幼苗根和叶片Ca2+旌旗灯号的相应差别及分歧刺激诱导的Ca2+旌旗灯号相应特征，得当分歧类型的Ca2+旌旗灯号相应渐变体的挑选和鉴定。AEQub资料因为应用Ubiquitin启动子驱动Apoaequorin的表白，削弱了基因缄默对Ca2+旌旗灯号检测的烦扰。应用该办法，已挑选鉴定获得多个Ca2+旌旗灯号加强或削弱的渐变体。(100yiyao.com）