Nature Genetics：终结无模型之困——肠道类器官技术为研究人类特异性病原体开辟新纪元

完美的 战场 在培养皿中重建 迷你肠道

要研究一场 战争 ，首先需要一个逼真的 战场 。传统的体外感染模型，通常使用永生化的系，例如源自宫颈癌的HeLa细胞。这些细胞虽然 生命力顽强 ，易于培养，但它们毕竟是 癌变 的产物，其形态、代谢、信号传导乃至细胞死亡的途径都与正常人体细胞大相径庭。用它们来研究病原体的感染过程，就如同在一个充斥着变异规则的虚拟世界里测试真实的作战策略，其结果的可靠性自然要大打折扣。

为了克服这一局限，研究人员将目光投向了近年来生命科学领域最耀眼的明星技术之一 类器官(organoid)。类器官，又被形象地称为 迷你器官 ，是从成体或多能干细胞在体外三维培养条件下，自组织形成的微型化、简化版的器官结构。它们拥有与来源器官高度相似的细胞类型、空间结构和生理功能。在这项研究中，研究人员从接受减重手术的患者的健康小肠组织（空肠）和接受手术的患者的癌旁正常结肠组织中，分离出肠道干细胞，在特殊的凝胶基质（Matrigel）中进行三维培养。这些干细胞像拥有建筑蓝图的工匠，自发地增殖和分化，形成了一个个中空的、包含隐窝和绒毛样结构的球形体，这就是肠道类器官（源自小肠的称为小肠类器官(enteroid)，源自结肠的称为结肠类器官(colonoid)）。

更巧妙的是，研究人员还掌握了控制这些 迷你肠道 朝向的 开关 。在自然状态下，肠道上皮细胞具有明确的极性，分为朝向肠腔的顶端(apical)和朝向基底膜和组织的基底外侧(basolateral)。志贺氏菌的主要入侵路径，是先通过M细胞等方式穿过上皮屏障，然后从防御相对薄弱的基底外侧 背后偷袭 。通过调控培养条件，研究人员可以培养出两种不同极性的类器官：一种是 基底朝外 (basal-out, BO)的，其基底外侧表面暴露在培养液中，完美模拟了志賀氏菌从 背后 攻击的场景；另一种是 顶端朝外 (apical-out, AO)的，其顶端表面朝外，模拟了细菌从肠腔正面进攻的情形。

有了这个高度仿真的 战场 ，研究人员首先要确认 战争 能够真实上演。他们将携带绿色荧光蛋白（GFP）的野生型志贺氏菌，与BO小肠类器官一同培养。在延时显微镜下，一幕幕精彩的 攻防战 被实时记录下来：感染3小时后，类器官上皮细胞内开始出现小规模的绿色荧光 火种 ，代表细菌成功入侵；随着时间推移，到9小时，这些 火种 迅速扩大，形成燎原之势，细菌不仅在单个细胞内大量繁殖，还通过其独特的肌动蛋白 彗星尾 在细胞间穿梭、扩散。这表明，类器官模型不仅能支持志贺氏菌的入侵，还能重现其关键的跨细胞传播过程。

为了量化这个模型的有效性，研究人员进行了一场 有控 实验。他们将野生型志贺氏菌与一种 手无寸铁 的突变株 mxiD株 混合后去感染BO类器官。*mxiD*基因编码的是III型分泌系统(Type-3 Secretion System, T3SS)的一个关键结构蛋白，T3SS是志贺氏菌入侵细胞的 注射器 ，缺失了它，细菌就无法将致病 效应蛋白 注入宿主细胞，从而丧失入侵能力。结果正如预期，感染6小时后，从每个培养孔中回收的野生型细菌数量平均约为10万个菌落形成单位（CFU），而 mxiD突变株的数量则少了超过60倍。这个巨大的差异证明，该模型具有极佳的动态范围，能够灵敏地区分出具有不同入侵能力的细菌，为后续的大规模筛选奠定了坚实的基础。

百万突变体大军 与 瓶颈 天险的挑战

拥有了完美的 战场 ，下一步就是派出 侦察兵 去探明敌人的底细。在功能基因组学中，TraDIS（转座子导向插入测序）就是这样一种强大的 侦察 技术。它的核心思想是，利用一种叫做转座子(transposon)的 跳跃基因 ，在细菌基因组中随机 降落 ，插入到不同的基因中，从而破坏该基因的功能。通过这种方式，研究人员可以构建一个庞大的突变体库，其中每个突变体都 牺牲 了一个特定的基因。这个库就像一支 百万突变体大军 ，每个 士兵 （突变体）都因为某个 装备 （基因）的缺失而拥有了独特的弱点，并且都带有一个独一无二的DNA 姓名标签 （转座子插入位点）。

筛选的逻辑很简单：将这支 大军 派去攻打 迷你肠道 这座堡垒。经过一番 激战 （感染过程）后，能够成功入侵并在细胞内存活下来的 幸存者 被回收。通过高通量测序，研究人员可以清点这些幸存者中都包含哪些 姓名标签 。如果在幸存者中，某个 姓名标签 的突变体数量相比于投入战斗前，显著减少甚至完全消失，那就说明这个突变体所缺失的那个基因，对于赢得这场 战争 至关重要。通过这种方式，理论上可以一次性评估细菌基因组中几乎所有基因在感染中的作用。

然而，理想与现实之间，往往隔着一道名为 感染瓶颈 (infection bottleneck)的天险。想象一下，一支庞大的军队要通过一个狭窄的山谷才能到达战场，无论士兵多么精良，山谷一次只能通过少数人。在这个过程中，很多优秀的士兵可能仅仅因为 运气不好 ，没能挤进通过的队伍而被淘汰，他们的 牺牲 与自身战斗力无关。感染过程也是如此。当大量的细菌接触宿主时，由于宿主的物理屏障、防御、营养限制等多种因素，最终只有极少数细菌能够成功建立感染灶。这种数量上的急剧缩减，就是 感染瓶颈 。

这个瓶颈效应会给TraDIS筛选带来巨大的噪音。它会导致许多功能正常的突变体，仅仅因为 运气差 ，在感染初期就被随机性地淘汰了，造成了 假阳性 结果 我们误以为它们缺失的基因很重要，而实际上并非如此。

为了量化这个 天险 的崎岖程度，研究人员进行了一项预实验。他们用包含1万或3万个不同突变体的文库去感染BO小肠类器官。结果发现，尽管投入了上万的突变体，最终在细胞内回收到的独特突变体种类只有大约1,500到4,000种。通过计算机模拟，他们进一步推算出，在这个实验体系中，感染瓶颈的大小约为2,000个细菌。这意味着，每次感染实验，只有大约2,000个幸运的细菌能够 通过山谷 ，这对于一个包含数万突变体的大军来说，无疑是一个极其严峻的挑战。

如何穿越这道天险，地 战报 ？这正是该研究最具创新性的地方之一。研究人员开发并应用了一个巧妙的数学工具 基于零膨胀负二项分布(Zero-Inflated Negative Binomial, ZINB)的贝叶斯模型。这个模型的核心思想是，它能够区分两种不同的 零 ：一种是由于突变体确实存在生存劣势而导致的 真零 ，另一种是由于瓶颈效应的随机淘汰而导致的 假零 （即零膨胀）。通过将这两种情况分开建模，研究人员能够从充满噪音的数据中，精准地提取出每个基因对感染适应性的真实贡献值。这就像是给 战报 分析师配备了一副能够分辨 真实伤亡 与 意外失踪 的 火眼金睛 。

意想不到的代价 武装到牙齿 的生长负担

在正式发起总攻之前，研究人员还细致地考虑了另一个可能影响战局的因素： 致病的代价 (cost of virulence)。对于志贺氏菌而言，其主要的攻击武器 III型分泌系统（T3SS） 是一套极其复杂和耗能的蛋白质机器。这套系统的表达受到环境温度的严格调控：在30 C时，它基本处于 关闭 状态；而在37 C（人体体温）时，它则会 开足马力 全速运转。

研究人员推测，维持并表达这样一套庞大的 军备 ，必然会消耗大量能量，从而拖累细菌自身的基础生长速度。为了验证这一点，他们进行了一项巧妙的对比实验。他们将一个包含约13万个突变体的巨大文库，分别在30 C和37 C的培养基中生长，并用TraDIS技术分析不同温度下各个突变体的适应性。

结果非常惊人。在37 C下，有大约1,200个基因的突变会影响细菌的生长适应性；而在30 C下，这个数字骤降至约130个，相差近十倍。这表明，在模拟人体感染的37 C条件下，细菌基因组中的大量基因都参与到与致病相关的复杂调控网络中。

更有趣的发现来自对T3SS相关基因的分析。当T3SS的 总司令 调控蛋白*virF*和*virB* 被突变后，这些突变株在37 C下的生长速度，反而比野生型更快了！这直接证明了 致病的代价 ：关闭了耗能的军备生产线后，细菌可以将更多资源用于自身繁殖。相比之下，突变单个的 武器 零件（如T3SS的结构蛋白或效应蛋白），则几乎没有这种生长优势。

这个发现对于后续的TraDIS筛选设计至关重要。如果在感染结束后，用37 C来富集回收的细菌，那么那些因关闭T3SS而获得生长优势的突变体，就会在富集过程中被 不成比例 地放大，从而干扰对它们在入侵阶段真实作用的判断。因此，研究人员做出了一个关键的决定：在后续所有感染实验中，对投入前（input）和回收后（output）的细菌文库，都在30 C下进行过夜富集。这个看似简单的温度调整，却巧妙地排除了 致病代价 带来的偏好，确保了筛选结果的纯粹性，只反映基因在入侵宿主细胞这一特定过程中的功能。

全基因组 通缉令 绘制志贺氏菌的入侵武器库

万事俱备，研究人员正式发起了对志贺氏菌基因组的 地毯式 普查。他们将第二个更大的Tn5突变体文库（包含约11.2万个突变体）分成了43个子文库，每个子文库包含约2,000-3,000个不同的突变体。这么做的目的是为了克服感染瓶颈 通过增加实验的重复次数（43次平行感染），确保基因组中的绝大多数基因都有机会被 测试 到。

他们用这43个子文库，分别去感染43孔板中培养的BO小肠类器官。感染6小时后，回收细胞内的细菌，在30 C下富集，然后提取DNA进行TraDIS测序。测序数据经过ZINB贝叶斯模型的 火眼金睛 处理后，一张前所未有的、详尽的志贺氏菌感染 基因通缉令 诞生了。

这张 通缉令 揭示了，在染色体上，有105个基因对于志贺氏菌成功定植小肠类器官至关重要。这些基因的功能五花八门，其中超过70个是首次被发现与志贺氏菌的感染能力相关。这批 新晋案犯 包括压力应答调节因子（如RpoS）、多种负责吸收营养或排出有毒物质的转运蛋白、参与代谢的相关酶，以及两个令人瞩目的编码tRNA修饰酶的基因 mnmE和mnmG。

在致病性质粒（pINV）上，有38个基因被证实是入侵所必需的。这在很大程度上验证了筛选的可靠性，因为这里面包含了所有我们已知的 惯犯 ，例如T3SS的 总司令 *virF* 和 *virB*、T3SS的 注射器 本身（几乎所有的*mxi*和*spa*家族基因），以及形成易位孔的关键 弹头 IpaB、IpaC、IpaD等蛋白。

这份覆盖了基因组86%区域的 通缉令 ，其深度和广度都是史无前例的。它不仅系统性地盘点了志贺氏菌的 武器库 ，还发现了一大批隐藏在幕后的 后勤官 和 情报员 ，为我们全面理解其致病机制提供了宝贵的路线图。

情境决定一切 病原体灵活多变的攻击策略

大规模的TraDIS筛选就像是用广角镜头拍摄战场，看到了全局态势。但要理解每个 精英士兵 的具体战术，还需要切换到 长焦镜头 进行精细观察。为此，研究人员采用了一种名为 条形码菌株联盟感染 (barcoded consortium infection)的技术，对TraDIS筛选出的部分关键 通缉犯 （主要是T3SS效应蛋白）进行验证和深入研究。

该技术可以看作是TraDIS的 迷你版 。研究人员选取几个特定的突变株，与野生型菌株和非入侵的 mxiD菌株一起，给它们各自的基因组中插入一段独一无二的、像商品条形码一样的DNA序列（tag）。然后，将这些带有不同 条形码 的菌株等比例混合成一个 联盟 ，用这个 联盟 去感染类器官。感染结束后，通过定量PCR (qPCR)技术，可以精确地计算出每种 条形码 的数量，从而得知每种突变株在竞争中的相对丰度。这种方法不仅实现了内部对照，结果高度可靠，而且可以灵活地应用于不同的 战场 即不同极性（BO/AO）和不同来源（小肠/结肠）的类器官。

通过这种精细的 战术分析 ，研究人员获得了一系列关于T3SS效应蛋白作用的深刻见解。例如，核心攻击手 IpgB1/IpgB2是不可或缺的 开路先锋 ，无论在何种情境下都发挥着关键作用，缺失它们会使细菌的入侵能力大幅削弱，尤其是在同时敲除两者时，缺陷会更加严重。

而 多面手 IpaA的作用则表现出了惊人的 上下文依赖性 。在模拟 背后偷袭 的BO类器官中，它的作用微乎其微；然而，当战场切换到模拟 正面强攻 的AO类器官时，缺失它的影响被急剧放大，入侵效率降低了约5倍。这有力地证明，志贺氏菌的攻击策略并非一成不变，IpaA蛋白是一件专门用于从顶端突破的 特种装备 。

总的来说，这些基于类器官的精细验证实验，不仅证实了TraDIS筛选结果的准确性，更揭示了志賀氏菌致病策略的复杂性和灵活性。它告诉我们，要真正理解病原体，就必须在最接近真实的生理情境中，去考察它的每一步行动。

幕后的 密码总管 RNA 校对员 如何掌控全局

在所有TraDIS筛选出的新 通缉犯 中，mnmE和mnmG这两个tRNA修饰酶基因无疑是最神秘和最引人遐想的。它们不像T3SS那样直接参与攻击，也不像代谢酶那样提供能量，它们的工作，发生在生命活动最核心的层面 蛋白质翻译。

为了揭开它们的秘密，研究人员首先证实了缺失这两个基因的突变株在入侵类器官时存在严重的缺陷，其定植能力比野生型低了6到10倍。这证实了TraDIS的结果，但问题是：为什么？

研究人员猜测，这背后可能隐藏着一种全局性的翻译调控机制。他们利用蛋白质组学(proteomics)技术，系统地比较了野生型菌株和这两个突变株中所有蛋白质的丰度。结果令人震撼：在突变株中，有154种蛋白的水平显著下调，其中25种都来自于那个至关重要的致病性质粒（pINV）！这些下调的蛋白几乎囊括了整个T3SS武器库的核心成员。

这就像是发现，敌军的整个兵工厂都停产了。而这一切的根源，竟然是两个看似不起眼的tRNA 校对员 的缺席。这背后的机制是什么呢？答案就藏在遗传密码的 方言 里。

我们知道，遗传密码具有简并性(degeneracy)，即多个不同的密码子可以编码同一种氨基酸。MnmE/G酶负责修饰特定几种tRNA，使得它们能够更高效地识别以A或G结尾的密码子。研究人员分析了志贺氏菌全基因组的密码子使用偏好性(codon usage bias)，发现致病性质粒上的 致病基因 ，显著地偏好使用一些特定的、甚至是稀有的密码子，其中最突出的是编码精氨酸的AGA和编码甘氨酸的GGA。而负责翻译这两个密码子的tRNA，恰恰就是需要被MnmE/G酶修饰的那几种！

谜底至此完全揭开。志贺氏菌在漫长的演化中，发展出了一套极其巧妙的全局调控策略。它将自己所有的 战争机器 的制造蓝图（致病基因），用一种特殊的 方言 （富含AGA、GGA等特定密码子）来书写。而MnmE和MnmG这两个酶，就如同这门 方言 的唯一 官方翻译官 。一旦 翻译官 缺席，这些用 方言 写成的蓝图就变得晦涩难懂，翻译效率急剧下降，整个兵工厂随之停摆。最后的基因回补实验也雄辩地证明，正是这种基于tRNA修饰和密码子偏好的翻译调控，构成了志贺氏菌致病程序的一个至关重要的、全局性的控制中枢。

新时代的 侦察手册

这项发表于《自然 遗传学》的研究，远不止于揭示了志贺氏菌的几个新 秘密 。它的真正价值，在于为我们研究那些最狡猾、最难对付的人类特异性病原体，提供了一套全新的、功能强大的 侦察手册 。

它告诉我们，通过将高度仿真的类器官模型（提供逼真的 战场 ）、高通量的TraDIS筛选（派出海量的 侦察兵 ）以及精密的计算生物学模型（配备解读战报的 火眼金睛 ）三者巧妙结合，我们能够以前所未有的分辨率和可靠性，系统地解码病原体在感染过程中的遗传需求和调控网络。

从鉴定出上百个新的致病相关基因，到发现T3SS效应蛋白依赖于入侵情境的灵活战术，再到最终揭示那个隐藏在遗传密码 方言 背后的全局翻译调控开关，这项工作层层递进，为我们描绘了一幅壮丽的微生物致病画卷。

更重要的是，这套 侦察手册 是可推广的。今天，我们用它来对付志贺氏菌；明天，我们就可以用它来研究分枝杆菌、伤寒沙门氏菌，甚至是那些同样难以建立动物模型的病毒。它为我们打开了一扇通往理解宿主-病原体相互作用新世界的大门，也为我们开发新的抗菌药物和治疗策略，照亮了前行的道路。在这个由微小生命主宰的星球上，拥有这样一本强大的 侦察手册 ，无疑让我们在维护自身健康的持久战中，增添了更多信心和希望。

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