RNA+DNA同时测序 可检测癌症组织中的基因交融和碱基渐变

以后的研讨标明，诸如NTRK(神运营养因子受体酪氨酸激酶)等罕有的交融变异事情能无效地驱动肿瘤产生，并成为多种脱靶向医治的靶标。基于DNA检测的年夜Panel可以笼罩几百个癌基因，是年夜范围探测渐变的强无力对象，但在交融/重排检测方面仍具有必定挑衅。靶向二代测序是一种可以综合判定癌症生物标记的办法，依据分歧的变更情形，肇端的检测资料可为DNA或 RNA，但辨别停止两次检测会添加任务担负且经常弗成完成，进而耽搁或完整没有检测到症结变异事情，特殊是那些无效的可靶向医治的交融事情。故单次检测中经过精简的法式即可同时剖析两种模板(DNA和RNA)是实践任务中的急切需求。

近日，由浙江省病院牵头，恒特基因等国际多家单元配合协作完成的一项研讨揭橥在医学范畴焦点期刊Clinical Chemistry上，标题为“Simultaneous Detection of Gene Fusions and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing Dual Nucleic Acid Templates in Unified Reaction”。作者们报道了一种整合的NGS检测办法，可以检测申报出从组织样本中提取的总核酸(TNA)中的多种变异类型，并极年夜地简化了变异检测流程。

研讨者们开辟了称为平行扩增数字优化测序(PANO-Seq)的检测办法，可以将组织样本中提取的总核酸(TNA)直接转化为一个NGS文库，而无需在试验操作进程中将基因组DNA(gDNA)和RNA辨别建库。应用PANO-Seq，他们从66例新颖的肺癌组织切片样本的预队列中检测到的渐变有：EGFR(27例)，KRAS(4例)，PIK3CA(4例)，BRAF和细胞周期依附性激酶克制基因(CDKN2A)(各1例)。此外，还判定到3例交融变异，包含2例EML4-ALK交融和1例驱动卵白家族成员5B-转染时代重排激酶(KIF5B-RET)交融，证实了一次同时检测多种变异类型和双模板检测的目的是实在可行的。

后续年夜样本量研讨中，研讨人员搜集了1095例患者的FFPE样本，这些样本的年限从小于1年到年夜于5年不等。本队列涵盖肺癌已知的各类亚型，包含815例腺癌(74.4%)，183例鳞状细胞癌(16.7%)和97例其他类型或未分类的病例(8.9%)。用于检测的靶向重测Panel含有179个扩增子，笼罩了10个基因的32个外显子和启动子(基于DNA检测点渐变和拔出缺掉)，基于RNA检测14个基因的交融变异，同时笼罩了3个基因的12个内含子，使得RNA质量差的样本可经过DNA模板来检测交融。

成果显示，胜利测序及剖析的文库，上靶率为60.1%，除重后均匀测序深度12622，70%以上目的区域测序深度到达0.2倍均匀测序深度以上。小于50bp的扩增子(模板完好性的目标)占比为48.9%。对培育的细胞系样本与FFPE样本的剖析成果停止比较，发明细胞系样本模板完好性明显高于FFPE样本，标明这些实践样本表示很年夜水平上受临床样实质量影响。值得留意的是，可经过调理引物池中相干引物的浓度便利地优化检测的均一性，标明这一检测平台是非常灵敏的。

相较于DNA，RNA不波动易降解，是以在NGS测序之前对样本的质量停止零碎评价长短常主要的。但是，传统的核酸定量检测办法，能够无法精确测定核酸模板的质量或区分RNA和DNA。研讨人员开辟了pre-NGS qRT-PCR 的质控办法，用来评价双RNA/DNA模板的质量，并剖析一切可取得的组织样本，证实其是一种在NGS任务流程中比传统办法更高效的检测办法。

以高于FFPE样本基线的5%MAF作为截断值，研讨人员发明，一切患者中有834例携带有至多一个渐变。总体上，DNA测序数据到达可承受的质控请求的患者中，有79%(739/935)携带一个相干渐变事情，且45%(421/935)位于热门区域。进一步，研讨者们将检测到的每一种渐变类型，至多取1例样本应用Sanger测序法独自检测，用于确证本检测的成果的准确性。对32例作为最罕见的渐变类型代表的EGFR_L858R病例和20例阴性的样本进一步停止验证，成果证明了一切成果均完整分歧。

一切患者中，有69例为交融阳性；在RNA测序数据到达可承受的质控请求的亚组中交融阳性率为7.7%(58/754)。个中ALK、ROS1、RET这三个基因的交融占了绝年夜多半的交融事情。别的还检测到6例MET 14号外显子跳读，1例HLA II类分子的组织相容性抗原DRB1的β链与MET产生的交融(HLA-DRB1-MET，这一交融之前仅被报道过一次)，以及BRAF(BBS9-BRAF和AGK-BRAF) 和神经调理卵白1 (NRG1) (CD74-NRG1和MKL2-NRG1)四例交融事情。在这一队列中另检出了多个NTRK1交融病例将另案报道。