Nat Biotechnol:利用CRISPR |
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来源:100医药网原创 2023-03-28 10:38
在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员将一种新的复合物整合到CRISPR-Cas系统中。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上。哺乳动物细胞由于亚细胞区室的存在而具有固有的复杂性,因而使得在分子生物学实验室中进行强有力的转录本靶向具有一定的挑战性。如今,在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员将一种新的复合物整合到CRISPR-Cas系统中。相关研究结果近期发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为 Precise transcript targeting by CRISPR-Csm complexes 。
该团队使用了CRISPR-Csm复合物,它包括一种称为Csm的蛋白,即一种在原核生物系统中发现的III-A型CRISPR-Cas干扰复合物。此后,他们通过单载体递送完成了细胞核和细胞质转录本的手术刀式RNA消融(剔除)。这种载体携带的嗜热链球菌Csm复合物提供了高效的RNA敲降(RNA knockdown);这是一种在人类细胞中使脱靶效应最小化的沉默基因表达的方法,并超过了现有的基因组编辑技术,如短发夹RNA和Cas13介导的敲降。通过让Csm失去催化活性,他们实现了持久的RNA结合,用于活细胞RNA成像,以确立CRISPR-Cas效应系统作为真核生物中RNA靶向工具的效率。
基因编辑:从RNA干扰方法到CRISPR-Cas复合物
分子生物学家们试图在不永久影响DNA的情况下改变RNA和蛋白水平;然而,在基础研究和治疗应用中,这项任务并不简单。在过去,科学家们通过使用RNA干扰(RNAi)在真核生物中开发了有针对性的RNA敲降技术,即小干扰RNA引导的Argonaute核酸酶(RNA诱导的沉默复合物的活性部分)切割互补的靶RNA。然而,这种方法导致了对携带部分相似或互补序列的RNA靶标的意外切割,特别是当这种互补性发生在siRNA的成核 种子 区域时,此外,它也与真核生物模型系统不兼容。
与此同时,现在广泛流行的CRISPR-Cas复合物在原核生物中形成对传染病原体的适应性防御系统,而且作为DNA或RNA核酸酶,经调整后可用于基因编辑应用。与小干扰RNA非常相似,Cas核酸酶含有通过互补的碱基配对识别靶核酸的小RNA。在这项新的研究中,论文第一作者、加州大学伯克利分校的David Colognori博士及其同事们将Csm蛋白作为RNA敲降或基因沉默的一种有吸引力的工具。该蛋白只存在于原核生物中,并且可以被引入真核生物,而不需要使用交叉的宿主调控途径,这使得他们能够证实Csm系统是真核生物中一种多功能的RNA敲降方法。
一体式III型CRISPR-Cas系统
这些作者选择来自嗜热链球菌的III-A型Csm复合物是基于几个特点:它在细菌中现有的生化和结构特征、最佳功能以及之前在斑马鱼胚胎和其他真核细胞(包括人类细胞培养物)中利用它进行的研究工作。他们验证了单个蛋白成分在永生化的人类胚胎肾细胞中的表达,并通过将所有成分整合到单一载体中简化了Csm系统的递送。他们用Csm敲降了高度过度表达的和异源的转基因,并在蛋白水平上研究了这种敲除的影响。
在人类细胞中的一体化III型CRISPR-Cas系统。图片来自Nature Biotechnology, 2023, doi:10.1038/s41587-022-01649-9。
在研究过程中,这些作者用一种一体化的载体转染人类胚胎肾细胞,使所有感兴趣的RNA达到90%以上的敲降。这些研究结果强调了Csm作为高效RNA敲降工具的高度稳健性。他们通过进行RNA荧光原位杂交(FISH)以观察特征形态来验证他们的结果。这项新研究展示了活性Csm复合物如何通过分子和微生物学相关的方法产生了类似的稳健敲降。
观察具有最小脱靶和细胞毒性的RNA敲降活性
为了评估细胞中Csm介导的RNA敲降的潜在脱靶效应,这些作者接下来进行了RNA测序。他们将这种复合物的敲降效率与现有方法进行了比较,并进行了48小时的RNA敲降。他们随后用转染的细胞进行了荧光激活细胞分选和测序。
这些结果显示Csm的表达并没有干扰细胞环境。他们不影响RNAse活性的情况下去除了DNAse活性,使得Csm介导的RNA敲降在人类细胞中的脱靶效应最小。当与产生严重细胞毒性的Cas13 RNA靶向CRISPR-Cas系统相比,这种III-A型Csm系统没有显示出抗RNA敲降的反式裂解活性,也没有毒性。
无需基因操纵的活细胞RNA成像
这些作者接下来试图了解在细胞中追踪RNA的过程。虽然在活细胞中追踪RNA的过程并不复杂,但是分子生物学家以前曾用RNA结合蛋白(比如无催化活性的Cas13)完成了这项任务。他们通过将绿色荧光蛋白(GFP)与无催化活性的Csm蛋白融合,探索了使用Csm复合物追踪活细胞中靶RNA的可能性。接下来,他们用Csm-GFP质粒转染了人类胚胎肾细胞系,并在48小时后进行了活细胞荧光显微镜检测,结果显示该蛋白可以轻易地在活细胞中观察到RNA。
展望
通过这种方式,这些作者展示了导入源自原核生物嗜热链球菌的III-A型Csm复合物作为实现真核生物RNA敲降和基因沉默的强有力工具的可能性。与现有的方法相比,他们进行的RNA敲降实验具有很高的效率和特异性,并超过了现有的竞争性方法。最值得注意的是,与其他基于Cas13的方法不同,该过程没有伴随可检测到的细胞毒性。
这些作者将这种多组分CRISPR-Cas系统有效转染到一种可递送的质粒中。以这种方式首次有效地将这种III-A型Csm复合物引入真核生物的能力对RNA、健康和体内合成生物学电路具有重大意义。( 100yiyao.com)
参考资料:
David Colognori et al. . Nature Biotechnology, 2023, doi:10.1038/s41587-022-01649-9.
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