Nature Biotechnology：血液中的“肠道私语”——一种颠覆性的癌症检测方法正在浮现

血液中的 幽灵信使 ：为何DNA不够，RNA来凑？

要理解这项研究的颠覆性，我们首先要回到液体活检的核心挑战。想象一下，一个早期的肿瘤，可能只有几毫米大小，它释放到全身几升血液中的cfDNA分子少之又少。传统的液体活检技术就像一个侦探，试图在巨大的信息海洋中找到这几个来自罪犯的 指纹 。这在技术上极其困难，导致很多早期癌症患者的检测结果呈假阴性，错失了最佳治疗时机。

此外，人体的衰老和正常组织的新陈代谢也会向血液中释放cfDNA，这些 良民 的DNA与来自肿瘤的DNA混杂在一起，形成了强大的背景噪音，进一步干扰了侦探的判断。面对这一困境，研究人员开始思考：除了DNA，血液中是否还漂浮着其他更灵敏的 信使 ？

他们的目光投向了DNA的 工作伙伴 RNA。

如果说DNA是细胞的 设计蓝图 ，记录着生命体的全部遗传信息，那么RNA就是根据这份蓝图发出的 实时工作指令 。细胞的每时每刻的活动，比如蛋白质的合成、能量的代谢，都由成千上万的RNA分子在精确调控。因此，RNA更能动态地反映细胞当下的生理或病理状态。一个和一个正常细胞，它们的 工作指令 必然大相径庭。

研究人员从健康人和结直肠癌（colorectal cancer, CRC）患者的血浆中，成功分离出了这些漂浮的游离RNA（cell-free RNA, cfRNA）。通过高分辨率的生物分析仪检测，他们发现了一个有趣的现象：这些cfRNA并非完整的长链，而是大多以非常短的片段形式存在，长度集中在50个核苷酸（nt）左右。这个尺寸，恰好与一类在细胞中负责搬运氨基酸的RNA 转运RNA（transfer RNA, tRNA） 非常相似。

这一发现至关重要。tRNA分子具有非常稳定、折叠紧密的三维结构，就像一个坚固的 旅行箱 ，这使得它比其他线性的RNA（如信使RNA, mRNA）更能抵抗血液中各种酶的降解。这或许解释了为什么在恶劣的血液环境中，我们依然能捕捉到大量的tRNA及其片段。它们就像是细胞凋亡或后散落的、最坚固耐用的 遗物 。研究人员推测，这些在血液中稳定存在的cfRNA，尤其是tRNA，可能携带着比cfDNA更丰富的疾病信息。

但真正让研究人员兴奋的，并非RNA序列本身，而是隐藏在序列之上的另一层信息密码 RNA修饰（RNA modification）。

这就像我们读书时，会在重要的句子下面划线，在段落旁边做批注，或者给某个词打上星号。这些标记虽然没有改变文字本身，却极大地改变了我们对信息的理解和处理方式。RNA分子在细胞中同样会被进行各种各样的 标记 ，比如在某个碱基上添加一个甲基（methylation），这些化学修饰会影响RNA的稳定性、功能及其与其他分子的相互作用。据，已知的RNA修饰超过170种。

研究人员提出了一个大胆的设想：癌细胞或肿瘤微环境中的细胞，其RNA上的 标记 模式是否会与正常细胞不同？如果答案是肯定的，那么这些独特的 标记 模式，将成为比DNA序列更灵敏、更特异的癌症生物标志物。这就好比，罪犯不仅留下了指纹（DNA），还留下了一张写有独特暗号的字条（RNA修饰），而破译这个暗号，将是抓到他的关键。

然而，破译这个 暗号 面临一个巨大的技术瓶颈。许多RNA修饰，特别是甲基化修饰，会像路障一样，阻断常规测序技术中负责读取RNA序列的 阅读器 逆转录酶。这使得我们无法获得完整的序列信息，更不用说准确定位和量化这些修饰了。要实现他们的设想，研究人员必须先打造一把能 越过路障 并 读懂暗号 的神奇钥匙。

LIME-seq：一把能破译微生物 摩斯密码 的神奇钥匙

为了解决这一难题，该研究团队开发并优化了一种名为 低起始量多重甲基化测序 （low-input multiple methylation sequencing, LIME-seq）的技术。这项技术的核心，在于选择了一个非常特殊的 阅读器 来自人类缺陷病毒（HIV）的逆转录酶。

大多数逆转录酶在遇到RNA修饰位点时会 卡壳 或脱落，导致测序失败。但HIV逆转录酶却与众不同，它具有一种 越障 能力，能够强行读过这些修饰位点。更有趣的是，在读过这些 路障 时，它虽然不会停下，但有很大概率会 犯个小错 ，即在对应位置合成一个错误的DNA碱基。

这个 错误 正是LIME-seq技术的精髓所在！研究人员将这个看似是缺陷的特性，转化为一个强大的信号。他们不再害怕酶的 失误 ，反而主动去捕捉这些 失误 。通过深度测序，如果在某个特定位点，大量测序读数都显示出从A到G的突变，那就强烈暗示原始的RNA分子在这个A位点上存在一个修饰。

这个过程就像一位侦探在检查一份电报，发现其中某些字母被打成了另一种摩斯密码。他意识到，这并非乱码，而是发报人故意留下的 暗号 。LIME-seq技术就是这样，它将RNA修饰这个物理信号，巧妙地转换成了测序数据中可被精确量化的突变信号。更重要的是，通过计算突变读数占总读数的比例，LIME-seq还能定量分析出该位点被修饰的化学计量比（stoichiometry），即有多少比例的RNA分子在这个位置上被 做了标记 。

为了验证这把 钥匙 是否可靠，研究人员首先在实验室常用的细胞系（HepG2）中进行了测试。他们提取了细胞中的小RNA，用LIME-seq进行分析。结果显示，该技术重复性极高，两次独立实验检测到的修饰谱，其相关性系数（r值）高达0.990（1代表完全一致）。此外，即便是将RNA起始量从50纳克（ng）降低到1.5纳克，不同起始量之间的检测结果依然高度一致（r值大于0.96）。这证明LIME-seq不仅精准，而且极其灵敏，足以处理临床样本中极其微量的cfRNA。

手握这把强大的 解码钥匙 ，研究人员终于可以开始探索血液中那些 幽灵信使 的秘密了。

惊人发现：血液中近40%的 悄悄话 竟来自肠道菌群！

当研究人员将LIME-seq技术应用于36名健康人的血浆cfRNA样本时，一个完全出乎他们意料的结果出现了。

按照常规思路，血浆中的cfRNA应主要来源于人体自身的细胞。测序数据经过处理后，确实有大约60-80%的读数能够比对到人类基因组上，其中tRNA和核糖体RNA（rRNA）的片段占据了主导地位，这与他们最初的观察相符。

然而，剩下的20-40%的测序读数，却在人类基因组中找不到 归宿 。它们成了 神秘序列 。研究人员并未放弃对这些序列的追寻，他们将这些序列与一个庞大的微生物基因组数据库进行比对。结果令人震惊：这些 神秘序列 绝大部分都来自于细菌！

这意味着，在我们的血液中，除了有人类细胞的 遗言 ，还漂浮着大量来自微生物的 悄悄话 。这些微生物cfRNA的片段长度同样很短，集中在30-50个核苷酸，主要也是tRNA和rRNA的片段。通过进一步的物种鉴定，研究人员发现，这些微生物RNA主要来源于几个特定的细菌 大家族 ，如芽孢杆菌目（Bacillales）、黄单胞菌目（Xanthomonadales）、伯克氏菌目（Burkholderiales）等。这些都是我们肠道微生物组中的常见成员。

这个发现颠覆了传统认知。我们的肠道虽然是一个相对封闭的系统，但肠道屏障并非坚不可摧。肠道中的微生物在生老病死、与宿主细胞相互作用的过程中，其细胞内容物，包括RNA，完全有可能 泄漏 到血液循环中。我们的血液，原来是一个比想象中更热闹的 信息交流中心 ，是宿主与微生物共生体之间信息传递的重要渠道。

但一个严谨的研究人员必须排除所有可能的干扰。会不会是抽血时，皮肤上的细菌污染了样本？为了验证这一点，研究人员进行了一个巧妙的对照实验。他们用同一根针头，从同一个人身上连续抽取了多管血液。如果污染主要来自皮肤，那么第一管血中的微生物信号应该最强，后续会逐渐减弱。但实验结果显示，多管血液样本的微生物谱高度一致。这有力地证明了，血液中的微生物RNA信号是真实存在的全身性信号，而非简单的局部污染。

至此，研究人员的眼前展现出了一幅全新的图景。他们不仅可以分析来自宿主（host）的cfRNA信号，还能同时监测来自微生物组（microbiome）的cfRNA信号。这就引出了一个核心问题：在诊断结直肠癌时，究竟谁才是更可靠的 线人 ？是人体自身的信号，还是这些肠道 房客 的信号？

终极对决：人类信号 vs. 微生物信号，谁是揪出癌症的 神探 ？

研究团队招募了27名结直肠癌（CRC）患者和36名健康对照者，利用LIME-seq技术对他们血浆中的cfRNA进行了全面分析，一场 终极对决 就此拉开帷幕。

人类信号的表现

首先，研究人员分析了来自人类基因组的cfRNA。他们发现，与健康人相比，CRC患者血浆中确实有一些人类RNA的丰度发生了变化，涉及约253个人类基因。同时，在人类tRNA的某些特定位点上，RNA修饰水平也存在差异。

这看起来很有希望。然而，当研究人员利用这些人类cfRNA的丰度和修饰数据，建立一个机器学习模型来区分癌症和健康样本时，结果却不尽人意。尤其是一个基于人类tRNA修饰特征构建的分类器，其表现非常平庸，其曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）值仅为0.55。

AUC是评估诊断模型性能的金标准。AUC值为1代表完美诊断，0.5代表完全随机的猜测（相当于抛硬币）。0.55这个数值，意味着该模型几乎没有区分能力。

为什么会这样？研究人员推测，血液中的人类cfRNA来源太复杂了。它们可能来自肝脏、肌肉、免疫细胞等全身各种组织，而不仅仅是结肠的肿瘤。这些来自非肿瘤组织的 噪音 信号，极大地稀释和掩盖了来自肿瘤的、真正有价值的 癌症信号 ，使得模型难以做出准确判断。

微生物信号的初次登场

在人类信号 折戟 后，研究人员将希望转向了微生物信号。大量前期研究已经证实，肠道微生物组的失调与结直肠癌的发生和发展密切相关。例如，某些特定菌群的异常增多，被认为是CRC的风险因素。

研究人员首先尝试了一个相对简单的方法：仅利用微生物cfRNA的丰度（abundance）信息。也就是说，他们只看哪些菌的RNA在CRC患者血液中更多或更少。他们基于这些丰度数据建立了一个分类模型。这一次，结果有了显著提升，模型的AUC值达到了0.77。

这是一个不错的成绩，证明了血液中的微生物RNA丰度确实能反映出结直肠癌的存在。它优于随机猜测，也比基于人类tRNA修饰的模型好得多。但这对于一个可靠的临床诊断工具来说，还远远不够。一个AUC为0.77的模型，在实际应用中仍然会有相当高的误诊率。

简单的丰度信息，似乎还不足以揭示故事的全貌。这促使研究人员祭出了他们的 终极武器 微生物RNA的修饰信息。

破案关键：癌症如何改变了微生物的 口音 ？

研究人员的核心假设是：癌症的存在，会给肠道微生物带来巨大的环境压力，从而改变它们的代谢活动和基因表达，最终体现为它们RNA修饰模式的系统性改变。

这就好比一个人长期生活在充满压力的环境中，他的说话方式、语调甚至口音都可能不自觉地发生变化。RNA修饰，就是微生物的 口音 。研究人员要做的，就是去聆听并分辨这种因癌症而改变的 口音 。

他们将LIME-seq检测到的、成千上万个微生物RNA修饰位点的定量信息，作为特征输入到一个更复杂的支持向量机（Support Vector Machine, SVM）模型中。SVM是一种强大的分类算法，它能在高维数据空间中找到一个最优的 分界线 （超平面），将癌症样本和健康样本最清晰地分离开。

当模型的训练和验证结果出来时，所有人都被震撼了。

这个基于微生物cfRNA修饰特征的模型，在区分CRC患者和健康对照时，展现出了前所未有的强大性能，其AUC值飙升至惊人的0.98！

这是一个接近完美的数值。它不仅远远超过了基于人类信号的AUC=0.55，也碾压了仅基于微生物丰度的AUC=0.77。在交叉验证中，该模型的整体准确率达到了95%，在最优阈值下，其灵敏度（正确识别出癌症患者的能力）为93%，特异性（正确识别出健康人的能力）为92%。

这是一个什么概念？目前临床上已获美国批准的、用于结直肠癌血液筛查的SEPT9基因甲基化检测，其灵敏度大约在70%左右。而这项新技术，尤其是其高达93%的灵敏度，意味着它有潜力发现更多真正的癌症患者，显著减少漏诊。

更令人振奋的是，这种高准确性在癌症的极早期阶段同样有效。分析显示，无论是原位癌（Stage 0）还是I期癌症，该模型都能以极高的概率将其成功识别。这恰恰解决了传统液体活检最大的痛点 早期诊断能力不足。通过聆听微生物的 口音 变化，研究人员似乎找到了那把能打开早期癌症诊断大门的钥匙。

这项研究的巧妙之处在于，它利用了生物系统的一个基本原理：应激反应。肿瘤微环境对微生物而言是一种强烈的 应激源 ，而RNA修饰是细胞（包括细菌细胞）响应应激的核心机制之一。因此，检测RNA修饰的变化，本质上是在检测微生物对癌症存在的 生物反应 ，这比单纯检测肿瘤自身脱落的物质（cfDNA）要灵敏得多。这就像通过观察一群鸟是否惊飞，来判断草丛里是否藏着猛兽，远比直接看到猛兽本身要容易和迅速。

揭秘 关键线人 ：哪些菌群在为癌症 通风报信 ？

一个AUC高达0.98的模型固然强大，但它也像一个 黑箱 ，我们只知道它能做出准确判断，却不清楚它是依据哪些线索。为了打开这个 黑箱 ，研究人员使用了一种名为SHAP（Shapley Additive Explanations）的分析方法。这个工具可以评估模型中每一个特征（即每一个微生物RNA修饰位点）对最终预测结果的贡献度，从而告诉我们，哪些菌的哪个 口音 变化，是区分癌症的 关键线人 。

分析结果揭示了一些与已知生物学知识高度吻合的 关键菌群 ：

伯克氏菌科（Burkholderiaceae）：该家族成员的RNA甲基化水平在CRC患者中显著上调。这类细菌通常被认为是机会主义病原体，在免疫力低下或环境失调时可能引发问题。

梭菌科（Clostridiaceae）：与前者相反，该家族成员的RNA甲基化水平在CRC患者中显著下调。有趣的是，某些梭菌（如溶癌梭菌）因其靶向肿瘤缺氧区域的能力，正被研究作为一种新型的抗癌疗法。

微杆菌科（Microbacteriaceae）：其成员的RNA甲基化水平也呈现上调。这类细菌同样与免疫功能受损个体的感染有关。

此外，该模型还重点识别出了几种已在多项研究中被证实与CRC密切相关的细菌，如厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）、中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）和微小微单胞菌（Parvimonas micra）。LIME-seq数据显示，在CRC患者中，这些特定细菌的cfRNA上的修饰水平（体现为突变率）显著高于健康人。

这些发现意义非凡。它不仅验证了模型的生物学合理性，还将抽象的AI预测与具体的微生物学知识联系起来。这表明，模型并非基于某些随机的统计巧合，而是真实地捕捉到了与CRC病理生理过程相关的微生物功能变化。我们不仅知道 谁 在报警，还知道它们是如何 报警 的。

不止于肠癌：我们是否推开了一扇疾病诊断新世界的大门？

这项研究的意义，远不止于为结直肠癌提供了一种新的筛查工具。它更像是一次 范式转移 ，为我们理解和诊断疾病提供了全新的思路。

首先，这项技术的临床实用性得到了初步验证。在真实的临床环境中，血液样本从采集到处理往往需要一定时间。研究人员模拟了这一场景，将血液样本在4 C下分别储存了2小时、8小时和24小时。结果显示，微生物cfRNA的修饰信号表现出惊人的稳定性，即使在储存8小时后，其信号谱与新鲜样本的相关性依然高达0.9以上；24小时后，相关性也维持在0.85以上。相比之下，人类自身的cfRNA信号则出现了较大的波动。这种稳定性，对于未来将该技术转化为标准化的临床检测至关重要。

其次，该方法的应用潜力可能超越结直肠癌。为了探索其普适性，研究团队进行了一项小规模的初步研究，将该模型应用于一种与肠道不直接相关的癌症 （pancreatic cancer, PANC）。令人惊讶的是，即使样本量很小（7名胰腺癌患者 vs 8名健康人），基于微生物cfRNA修饰的模型，依然能够清晰地将两组人群区分开来。这暗示着，不同类型的癌症，即使病灶位置遥远，也可能通过某种系统性的机制（如炎症反应）对肠道微生物组产生深远影响，而这种影响，可以被血液中的微生物 口音 所捕捉。

最后，这项研究为我们打开了一扇观察 人-微共生体 健康状态的窗户。我们的身体并非一个孤立的系统，而是与体内数万亿微生物共同构成的一个 超级有机体 。微生物的健康，就是我们身体健康的延伸。微生物的 不安 ，往往预示着宿主正面临着疾病的威胁。LIME-seq技术，就像一个超高灵敏度的 听诊器 ，让我们第一次能够如此清晰地听到来自这个 第二基因组 的信号。

未来，这项技术或许不仅能用于癌症诊断，还可能应用于其他与肠道菌群失调相关的疾病，如炎症性肠病（IBD）、自身免疫病、甚至代谢性疾病和神经退行性疾病的早期预警和监控。通过解读血液中这些 肠道私语 ，我们或许能以前所未有的视角，洞察疾病的发生机制，并实现真正的个性化精准医疗。

当然，任何一项新技术的诞生，从实验室走向临床，都还有很长的路要走。这项研究的样本量相对有限，还需要在更大规模、更多样化的人群中进行验证。但它无疑已经为我们指明了一个无比激动人心的方向：在我们与体内微生物的古老共生关系中，蕴藏着解读健康与疾病的终极密码。而现在，我们终于开始学着去倾听了。

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