Nat Biotechnol：应用I型CRISPR/Cas零碎对人细胞停止靶向转录调理

2019年10月7日讯/BIOON/---在一项新的研讨中，美国杜克年夜先生物医学工程副传授Charles Gersbach、Gersbach试验室博士后研讨员Adrian Oliver及其团队初次描绘了他们若何胜利天时用I型CRISPR零碎开启和封闭基因，并对人细胞中的表不雅基因组停止编纂。他们愿望这可以极年夜地扩大生物医学工程师可用的基于CRISPR的对象，从而开启一个多样化的基因组工程技巧新范畴。相干研讨成果近期揭橥在Nature Biotechnology期刊上，论文题目为“Targeted transcriptional modulation with type I CRISPR–Cas systems in human cells”。

表示图指出罕见的dCas9零碎（下面）和Cascade零碎（上面）的组分，图片来自Gersbach Lab。 CRISPR-Cas是一种进攻零碎，在这种零碎中，应用RNA分子和CRISPR相干卵白（Cas卵白）靶向并毁坏入侵病毒的DNA。跟着迷信家们学会了若何应用这种零碎来特异性靶向和编纂人细胞中的DNA，这一景象的发明和对这种零碎的从新应用掀起了基因组编纂反动。

CRISPR-Cas9是当今最常用的基因组编纂对象，被归类为II型CRISPR零碎。II型CRISPR零碎在界并不罕见，但从实际上讲它们更易于操作，这是由于它们仅依附一种Cas卵白来靶向和切割DNA。

I型CRISPR零碎并不是那么复杂，它依附多种卵白在称为Cascade（CRISPR-associated complex for antiviral defense，用于抗病毒进攻的CRISPR相干复合物）的复合物中配合感化来靶向DNA。在联合DNA后，Cascade招募Cas3卵白来切割DNA。

Gersbach说：“假如探求世界上一切的CRISPR零碎，快要90％是I型CRISPR零碎。CRISPR-Cas生物学是生物技巧对象的极好起源，但直到比来，每团体都只存眷个中的一小部门。”

为了证明I型CRISPR零碎的功效，Oliver将基因活化剂衔接到了年夜肠杆菌I型Cascade复合物的特定位点上，从而让这种零碎靶向联合调理基因表达程度的启动子。鉴于她在试验中没有应用Cas3卵白，是以不存在DNA切割，也就不会改动DNA序列。这项试验标明这种Cascade活化剂不只联合准确的位点，并且可以进步靶基因的表达程度，并且如许做的精确性和特异性与CRISPR/Cas9相当。

Oliver应用来自另一种菌株的I型Cascade复合物反复了该进程，成果发明它可以在多个靶位点上强效地发扬感化。她还发明可以将这种活化构造域（即后面的活化剂）交换为隔绝物，从而封闭靶基因。这些研讨人员再次指出，这种办法的精确性和特异性可与CRISPR/Cas9办法媲美。

Oliver说：“我们发明Cascade的构造是极具模块化的，可以在多个位点上衔接活化剂或隔绝物，这是改动人细胞基因表达的主要对象。Cascade的灵敏性使得它成为有远景的基因组工程技巧。”

Gersbach和Oliver在邻近的北卡罗莱纳州立年夜学的协作者Rodolphe Barrangou传授和Chase Beisel传授的鼓舞下研讨了这种更为庞杂的I型CRISPR零碎。Barrangou是一位微生物学家，曾经研讨了各类CRISPR进攻机制的天然生物学特征近二十年，而Beisel是一位化学工程师，他与Barrangou一路对携带I型CRISPR零碎的微生物停止改革。他们都很猎奇Gersbach试验室能否可以像CRISPR/Cas9一样在人体细胞中应用I型CRISPR零碎。

Barrangou说：“这项研讨及其所发生的技巧是北卡罗莱纳州研讨三角（North Carolina Research Triangle）地带的跨学科和跨年夜学的协作若何具有高度立异性和富有成效的绝佳示例。”

现在，Gersbach团队对他们的研讨以及该范畴其他研讨人员的相干研讨觉得悲观，这将激起对I型CRISPR零碎的新研讨。

Gersbach说：“这个研讨项目标目标是探求CRISPR零碎的多样性。在过来的十年中，曾经有不计其数篇关于CRISPR/Cas9的论文，然则我们不断在不时懂得有关它的新常识。经过这项研讨，我们将这种思想方法使用到了CRISPR零碎的剩下90％部门。”

到今朝为止，该团队证明I型CRISPR零碎在精确性和使用方面可与CRISPR/Cas9媲美。当他们思索将来的研讨偏向时，他们想要探求I型CRISPR零碎与II型CRISPR零碎之间的差别，以及这些差别若何对生物技巧使用有效。

Gersbach团队还对研讨I型CRISPR零碎若何处理CRISPR-Cas研讨所面对的普通挑衅感兴味，特殊是让潜在医治使用庞杂化的成绩，比方对Cas卵白的免疫反响以及同时应用多品种型的CRISPR完成分歧基因组工程功效。