Nature Genetics：颠覆认知!KDM4C另辟蹊径，竟通过“组蛋白剪辑”扼杀乳腺癌!

KDM4C 隐藏在乳腺癌深处的 幕后推手

在细胞的生命活动中，表观遗传学（epigenetics）扮演着至关重要的角色，它像一个精密的 总开关 ，决定了哪些基因被打开，哪些基因被关闭。而组蛋白修饰酶（histone modifiers）就是这个 总开关 的者。它们通过在组蛋白（histone）上添加或移除化学标记，改变染色质（chromatin）结构，从而影响基因的表达。当这些修饰酶发生突变时，细胞的命运就可能被改写，甚至走向癌症。

研究团队长期关注一种名为KDM4C的组蛋白赖氨酸去甲基化酶（histone lysine demethylase, HDM）。之前已知，KDM4C在某些肿瘤中扮演着重要角色，例如它在髓系（acute myeloid leukemia）中能通过影响表观遗传重塑来促进疾病发展，在胶质母细胞瘤（glioblastoma）中则通过调节p53-MYC通路来影响肿瘤发生。但在乳腺癌中，KDM4C究竟是如何 兴风作浪 的，其具体机制一直不甚明朗。

通过对大型乳腺癌患者队列数据（如癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和国际乳腺癌分子分类联盟（Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium, METABRIC））的分析，发现KDM4C是TNBC中最常发生突变的组蛋白去甲基化酶基因之一。具体来看，在TCGA的TNBC队列中，KDM4C的扩增频率达到10%，在METABRIC队列中也达到了9%。更重要的是，KDM4C的扩增与基底细胞样乳腺癌亚型密切相关，并且扩增细胞系也更常见于基底细胞样或三阴性乳腺癌。研究人员还发现，在病人源异种移植模型（patient-derived xenograft, PDX）、原发性TNBC肿瘤和细胞系中，KDM4C的扩增程度与KDM4C的mRNA和蛋白质水平呈正相关。这些数据强烈暗示，KDM4C在基底细胞样乳腺癌中可能是一个不容忽视的致癌基因。

为了验证KDM4C在基底细胞样乳腺癌中的功能，研究人员选择了四种KDM4C扩增的基底细胞样乳腺癌细胞系（包括SUM149, HCC1954, HCC38, HCC70）和四种未扩增细胞系（包括HCC1806, HDQP1, HCC1143, HCC1569）进行实验。通过慢病毒（lentiviral）介导的四环素（doxycycline）诱导型短发夹RNA（shRNA）技术降低KDM4C的表达，结果显示，在所有KDM4C扩增的细胞系中，的体外生长和体内肿瘤生长（xenograft growth）都显著下降。即使在一些KDM4C表达中等的非扩增细胞系（如HCC1806）中，抑制效果也依然明显。同时，使用KDM4家族酶的小分子抑制剂ML324和QC6352进行处理，发现它们也能显著降低多种细胞系的活力，其中QC6352表现出更高的选择性和效力。例如，PRISM化合物筛选平台数据显示，基底细胞样细胞系对QC6352的敏感度高于管腔细胞系。

进一步的实验证实了KDM4C的去甲基化酶活性是其促肿瘤作用的关键。当在SUM149细胞中过表达野生型KDM4C（wild-type KDM4C, WT）时，KDM4C缺失导致的生长抑制现象得到了挽救；但过表达催化失活突变体KDM4CS198M（catalytically inactive-mutant KDM4CS198M）则无法挽救，这表明KDM4C的去甲基化酶活性对其功能至关重要。此外，抑制KDM4家族的其他成员KDM4A或KDM4B对细胞生长没有影响，这进一步强调了KDM4C在基底细胞样乳腺癌中的特异性。

综合来看，KDM4C在临床样本和实验模型中均表现出明确的致癌作用，是基底细胞样乳腺癌中一个重要的 幕后推手 。

令人困惑的转录组与染色质图景 常规武器 为何失灵？

为了深入探究KDM4C抑制导致肿瘤生长受阻的分子机制，研究人员首先进行了RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）和染色质沉淀测序（chromatin immunoprecipitation followed by sequencing, ChIP-seq）。

RNA-seq结果显示，KDM4C下调或抑制剂处理在KDM4C扩增的基底细胞样细胞系中引起了更显著的转录组变化。基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）揭示，多种重要的代谢途径（如稳态（cholesterol homeostasis）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation））在KDM4C扩增的细胞系中受到一致性抑制。这与TCGA队列中KDM4C扩增和非扩增TNBC之间差异最显著的代谢途径一致。此外，还在所有测试细胞系中观察到转化生长因子 （TGF- ）信号通路和上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）的激活，这提示细胞状态发生了转变。

然而，令人意外的是，当目光转向KDM4C的 常规武器 它所去甲基化的经典组蛋白底物三甲基化组蛋白H3赖氨酸9（trimethylated histone H3 lysine 9, H3K9me3）和赖氨酸36（lysine 36, H3K36me3）时，ChIP-seq结果却显示，在KDM4C扩增的基底细胞样细胞系中，无论是shKDM4C下调还是ML324处理，H3K9me3和H3K36me3的整体信号强度都没有发生实质性改变。例如，在HCC1954和SUM149细胞中，这两处甲基化水平保持相对稳定，只有在ML324处理的SUM149细胞中H3K36me3略有下降，但总体变化并不显著。这与在KDM4C非扩增细胞系（如HCC1806）中观察到的H3K9me3和H3K36me3的明显变化形成了鲜明对比，在HCC1806细胞中，H3K9me3和H3K36me3的信号变化分别达到了显著性（p 0.0004和p 0.0005）。这暗示KDM4C在扩增背景下的作用可能超出了其经典的去甲基化功能。

尽管对经典底物的直接影响有限，但转座酶可及染色质测序（Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing, ATAC-seq）显示，KDM4C抑制在所有细胞系中都引起了广泛的染色质可及性重塑（chromatin remodeling）。在HCC1954和HCC1806细胞中，染色质开放性（open chromatin）显著增加，而在SUM149细胞中也有所增加，尽管不那么明显。研究人员还发现，KDM4C与三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4me3）和乙酰化组蛋白H3赖氨酸27（H3K27ac）的结合位点存在显著重叠，这进一步支持了KDM4C在染色质重塑中的作用。KDM4C抑制导致H3K4me3峰值发生显著改变，例如，在HCC1954细胞中，H3K4me3峰值增加了22.1%，丢失了12.9%；在SUM149细胞中，H3K4me3峰值增加了22.8%，丢失了27%。

这一发现提出了一个关键问题：如果KDM4C不是通过改变其经典去甲基化底物来发挥作用，那它又是如何影响染色质结构和肿瘤生长的呢？答案将在下一幕揭晓。

震惊！组蛋白H3竟被 剪辑 ！

面对KDM4C抑制导致染色质广泛重塑，但其经典去甲基化底物变化却不显著的矛盾现象，研究人员决定采用组蛋白质谱分析（histone mass spectrometry, MS）来全面、无偏地分析组蛋白修饰模式的全局变化。

结果令人震惊！在ML324处理的SUM149和HCC1954细胞中，几乎所有对应于组蛋白H3和H4 N-末端部分的组蛋白标记都发生了缺失。这种同步的缺失强烈暗示，组蛋白可能发生了蛋白水解性剪切（proteolytic cleavage），移除了其N-末端。为了验证这一假设，研究人员对提取的组蛋白进行了无偏蛋白组学分析，发现了与非经典剪切事件一致的肽段。例如，剪切的H3肽段TKAAR的总离子流色谱信号强度在KDM4C抑制的HCC1954和SUM149细胞中普遍增加，而在T47D细胞中变化有限。

使用C-末端H3抗体的免疫印迹分析（immunoblot analysis）进一步证实，在四种KDM4C扩增的细胞系中，KDM4C下调或抑制剂处理特异性地导致了N-末端组蛋白H3尾部剪切的增加。值得注意的是，N-末端H3抗体未能检测到明显的差异，这很可能是因为剪切后的肽段迅速降解。此外，KDM4A或KDM4B的下调并未引起组蛋白尾部剪切，而KDM4C诱导的剪切可通过过表达野生型KDM4C（而非催化失活突变体KDM4CS198M）来阻止，这表明剪切事件是KDM4C特异性的，并且需要其去甲基化功能。

为了确定介导KDM4C缺失诱导的组蛋白H3和H4尾部剪切的内肽酶（endopeptidase），研究人员在各种蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）存在下重复了质谱分析。结果表明，组织蛋白酶L（cathepsin L, CTSL）的抑制剂（CTSLI-III和SID2668150）或半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d可以减少组蛋白剪切。这明确将CTSL鉴定为负责H3剪切的最强候选者。有趣的是，H4肽段的缺失仅被天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃蛋白酶A（pepstatin A）部分挽救，暗示H3和H4的蛋白水解机制可能有所不同。CTSL此前被报道在小鼠胚胎（embryonic stem cells, ESCs）中精确剪切H3在丙氨酸21（H3A21）位置，这与观察结果一致。

进一步的研究显示，KDM4C阻断或下调后，细胞内CTSL活性显著增加，且仅在KDM4C扩增的细胞系中。例如，SUM149和HCC1954细胞中CTSL活性增加更为明显，这可能与其较高的基础CTSL表达水平有关。这种CTSL的激活是KDM4C特异性的，因为在KDM4A或KDM4B下调后并未观察到。过表达野生型KDM4C（而非催化失活突变体KDM4CS198M）可以减弱CTSL的激活，进一步证明了KDM4C去甲基化功能的重要性。

最关键的证据来自CTSL基因敲除（CTSL knockout, CTSLKO）实验。研究人员在五种基底细胞样乳腺癌细胞系中删除了CTSL，结果显示，在所有三种KDM4C扩增的细胞系中，KDM4C抑制诱导的H3剪切显著减少。这些结果明确建立了KDM4C去甲基化活性与通过CTSL介导的组蛋白H3剪切进行染色质重塑之间的联系，尤其是在KDM4C扩增的细胞系中。

幕后联盟 GRHL2、CTSL与 甲基化指令

既然CTSL是组蛋白剪切的关键执行者，那么它是如何被招募到染色质上执行这一任务的呢？CTSL本身不具备已知的DNA结合结构域（DNA-binding domain）。

为了解答这一问题，他们对CTSL进行了快速免疫沉淀质谱分析（rapid immunoprecipitation MS, RIME），识别与CTSL相互作用的蛋白质。结果发现，GRHL2（grainyhead-like 2）转录因子是CTSL免疫沉淀物中最丰富的蛋白质之一，并且是CTSL结合峰中最显著的预测转录因子基序（transcription factor motif）。

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）实验证实了KDM4C、GRHL2和CTSL三者在细胞核中的相互作用。更重要的是，在SUM149细胞中删除GRHL2，导致KDM4C免疫沉淀物中CTSL的缺失；反之，删除CTSL也导致CTSL免疫沉淀物中GRHL2和KDM4C的缺失，这排除了抗体交叉反应的可能性。这有力地表明GRHL2是CTSL的染色质招募者。

GRHL2的ChIP-seq进一步显示，CTSL的几乎所有结合位点都与GRHL2的峰值重叠，这证实了它们在染色质上的共定位。此外，在GRHL2敲除的SUM149细胞中，CTSL的染色质结合几乎完全丧失，并且KDM4C抑制引起的组蛋白H3剪切也显著减弱。这些结果再次强调了核内CTSL在此过程中的关键作用。

更令人兴奋的是，发现KDM4C抑制会导致GRHL2发生赖氨酸甲基化（lysine methylation）。通过对QC6352处理的SUM149细胞中GRHL2免疫沉淀物的质谱分析，识别出GRHL2上存在赖氨酸94（K94）和赖氨酸453（K453）两个单甲基化位点（monomethylated sites）。为了探究这些甲基化事件的功能相关性，敲低了内源性GRHL2，然后过表达野生型GRHL2或其赖氨酸-精氨酸突变体（无法被甲基化）。结果发现，过表达野生型GRHL2或K94R突变体可以挽救KDM4C抑制导致的组蛋白H3剪切和CTSL激活，但过表达K453R或K94R/K453R双突变体则无法挽救。这表明，GRHL2在K453位的单甲基化是KDM4C缺失诱导CTSL激活和组蛋白H3剪切所必需的。

这意味着KDM4C并非直接去甲基化组蛋白，而是通过调节GRHL2（CTSL的染色质招募者）的甲基化状态来间接影响CTSL的活性。当KDM4C被抑制时，GRHL2的K453位甲基化水平升高，这如同一个信号，触发了CTSL的活性，从而导致组蛋白H3的剪切。这揭示了一个精巧而复杂的信号通路。

下游连锁反应 代谢失衡与 氧化应激

组蛋白H3剪切在细胞内究竟会引发什么后果？研究人员发现它与细胞的氧化还原平衡（redox balance）和代谢途径（metabolic pathways）息息相关。

极性代谢物分析（polar metabolite profiling）显示，KDM4C抑制在KDM4C扩增的基底细胞样细胞系中引起了广泛的代谢组学变化，例如在HCC1954、SUM149和HCC70细胞中观察到明显的代谢改变，而在管腔ER+T47D细胞中则变化甚微。次黄嘌呤（hypoxanthine）水平升高，而还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）是受影响最显著的下调代谢物之一，同时其氧化形式氧化型谷胱甘肽（oxidized GSH, GSSG）的水平也降低，GSH/GSSG比值也随之下降。这表明KDM4C抑制导致了谷胱甘肽生物合成途径（GSH biosynthesis pathway）的抑制，从而引起了整体的氧化还原失衡。研究人员还在TCGA数据中发现KDM4C的mRNA水平与GCLC的mRNA水平呈显著正相关，进一步支持了这一通路在临床上的重要性。

在机制上，KDM4C抑制导致谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC）的表达下调，GCLC是GSH合成的限速酶。在KDM4C扩增的细胞系中，GCLC启动子区域的染色质可及性显著降低，且该区域与CTSL、GRHL2和KDM4C的结合位点存在重叠，这暗示GCLC的下调可能是CTSL介导的组蛋白H3尾部剪切的结果。更重要的是，KDM4C抑制或下调导致了细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平的显著升高。过表达野生型KDM4C可以挽救ROS水平的升高。

研究人员进一步探究了ROS与组蛋白剪切之间的关系。直接用H2O2刺激或通过丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine, BSO）阻断GSH合成，均能增加组蛋白剪切和CTSL活性，这表明ROS可以诱导组蛋白剪切和CTSL激活。反之，添加谷胱甘肽乙酯（GSH ethyl ester, GSE-EE，一种细胞可渗透的GSH形式）则能有效降低CTSL活性并减少组蛋白H3剪切。

为了理清事件的发生顺序，进行了时间序列分析（time course experiment）。结果显示，CTSL活性在KDM4C抑制剂处理后24小时内就开始逐渐升高，而ROS水平则在36到60小时后才开始显著升高。这提示，GRHL2 K453位甲基化引起的CTSL激活可能是初始触发事件，而GSH水平下降和ROS增加则是下游事件，并可能通过正反馈进一步增强CTSL活性。

最终的证明 阻断CTSL，逆转肿瘤生长

所有的线索都指向了CTSL介导的组蛋白剪切在KDM4C抑制诱导的肿瘤生长受阻中扮演着核心角色。为了提供最终的实验证据，研究人员进行了CTSL基因敲除（CTSLKO）的挽救实验。

在小鼠异种移植模型（xenograft model）中，敲除CTSL可以完全逆转KDM4C抑制引起的肿瘤生长抑制效应。例如，在SUM149异种移植模型中，QC6352显著抑制了肿瘤生长，但在CTSLKO的SUM149细胞中，这种抑制效应消失了。这意味着CTSL的活性对于KDM4C抑制导致的肿瘤生长抑制至关重要。

不仅如此，CTSL敲除还部分挽救了KDM4C抑制引起的ROS升高，并且阻止了GSH水平的下降。这进一步强调了CTSL-GCLC轴在KDM4C缺失引起的代谢和表观遗传重塑以及肿瘤生长抑制中的关键介导作用。

这些结果共同描绘了一个全新的通路：KDM4C失活 GRHL2的K453位甲基化增加 GRHL2招募CTSL到染色质 CTSL剪切组蛋白H3 组蛋白H3剪切引起GCLC表达下调 GSH合成受阻 细胞内氧化应激增加 肿瘤生长受抑制。

解锁新的治疗希望

这项研究揭示了KDM4C的一个独特功能，它将细胞氧化还原调节（cellular redox regulation）与染色质重塑（chromatin remodeling）紧密联系起来。KDM4C在基底细胞样乳腺癌中并非仅仅作为组蛋白去甲基化酶通过传统方式发挥作用，而是通过调控GRHL2的甲基化状态来激活CTSL，从而导致组蛋白H3的蛋白水解性剪切。这一过程进一步导致谷胱甘肽合成受阻，并最终引发氧化应激，抑制肿瘤生长。

这一发现为基底细胞样乳腺癌的治疗带来了新的曙光。针对KDM4C的抑制剂，例如研究中使用的ML324和QC6352，有望成为治疗这种高侵袭性乳腺癌的新型药物。更令人振奋的是，鉴于KDM4C-GSH-CTSL轴与铂类化疗（cisplatin chemotherapy）敏感性存在关联，未来的治疗策略可能涉及KDM4C抑制剂与靶向谷胱甘肽通路（GSH pathway）的药物（如顺铂）进行联合用药。例如，联合使用QC6352和顺铂在HCC3153细胞中表现出协同生长抑制作用，且这种协同作用可被BSO（GSH合成抑制剂）增强。而CTSL敲除则能消除QC6352和顺铂协同作用的增强。这为未来针对KDM4C扩增的基底细胞样乳腺癌患者提供了一个有潜力的临床试验方向。

当然，还需要在更大规模的临床样本中进一步验证GRHL2甲基化及其与CTSL活性的关联。同时，KDM4C扩增的基底细胞样乳腺癌中KDM4C-GRHL2-CTSL通路的演变机制也值得深入研究。

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